特異遺伝子の検出を利用した培養不可能状態のビブリオの生態学的研究

Research Project

Project/Area Number	08877054
Research Category	Grant-in-Aid for Exploratory Research
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Bacteriology (including Mycology)
Research Institution	Okayama University
Principal Investigator	篠田純男岡山大学, 薬学部, 教授 (50029782)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	三好伸一岡山大学, 大学院自然科学研究科, 助手 (60182060) 友近健一岡山大学, 薬学部, 助教授 (00093691)
Project Period (FY)	1996 – 1997
Project Status	Completed (Fiscal Year 1997)
Budget Amount *help	¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000) Fiscal Year 1997: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000) Fiscal Year 1996: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Keywords	腸炎ビブリオ / 生態学 / PCR / 培養不可能細胞
Research Abstract	ビブリオ属菌は自然環境水を棲息域とする細菌であるが,コレラ菌や腸炎ビブリオのような病原種も存在する。これらの病原種は低水温期や非流行期には検出されないが,その原因の一つに菌が生きてはいるが培養法では検出されない状態(viable but non-culturable : VBNC)で存在しており,何らかの要因で培養による検出が可能な細胞になるとの考えが出てきている。したがって,VBNC細胞としての生態を調査し,VBNCへの移行あるいはその逆が,どのような機構によるのかを明らかにすることは,予防衛生上重要である。しかし培養不可のため,検出が困難であるので,本研究ではビブリオ属菌の特異抗原である側毛の遺伝子配列を用いるpolymerase chain reaction (PCR法)により検出する方法を開発し,さらにVibrio mimicusの溶血毒の遺伝子塩基配列を決定して,PCR法開発につながる情報を得た。さらに,実験室的にVBNC細胞を誘導し,さらにこれを復帰させるための基礎実験を行った。他の細菌では低温低栄養の条件でVBNC細胞が誘導されやすいことが知られている。腸炎ビブリオを低温条件におくと,低栄養の場合は全菌数はあまり変わらず,生菌数は2段階の緩やかな減少曲線を示すが,栄養が豊富な場合は菌は速やかに死滅した。低栄養条件の場合には生菌数が一定した第II相が存在し,ここではおそらく何らかの平衡状態が保たれているものと思われる。そこで第II相の菌液に還元剤の添加実験を行ったところ,菌の増殖には影響のない濃度にも関わらず,急激な生菌数の減少が観察された。このことは,第II相が一定の酸化還元電位にある可能性を示唆している。第II相における生菌数と全菌数の大きな差はVBNC細胞の存在を示唆しているが,ヒートショック等による培養可能細胞への復帰は見られなかった。今回の研究では,最適なVBNC誘導条件や,再生条件を見出すことは出来なかったが,低温・低栄養条件への適応などVBNC研究に資する有用な情報が得られた。