エナメル芽細胞におけるRNAフィンガーブリンティング

Research Project

Project/Area Number	08877276
Research Category	Grant-in-Aid for Exploratory Research
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Functional basic dentistry
Research Institution	Nagasaki University
Principal Investigator	加藤有三長崎大学, 歯学部, 教授 (20014128)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	坂井英昭長崎大学, 歯学部, 助教授 (40225769)
Project Period (FY)	1996 – 1997
Project Status	Completed (Fiscal Year 1997)
Budget Amount *help	¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000) Fiscal Year 1997: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000) Fiscal Year 1996: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
Keywords	エナメル芽細胞 / ディフィレッシャルディスプレー / PCR / mRNA / ディフィレンシャルディスプレー
Research Abstract	15-25週齢Wistar系ラット上顎切歯のエナメル芽細胞層を3分割に剥離し、歯胚側からそれぞれ基質形成期、成熟期前期、および成熟期後期とし、それぞれの細胞層からtotal RNAを回収した。下流アンカープライマーT15V(5´CCCT15V3´ VはA,G,Cのいずれか)を用いて逆転写反応を行いfirst strand cDNAを合成した。次いで、上流プライマー(20mer)を添加し、PCRを行った。PCR産物をポリアクリルアミドゲルで展開し、3つの細胞分化段階で産生量の違いが見られるバンドを切り出し、DNAの配列を決定した。現在までに、基質形成期:25クローン、成熟期前期:3クローン、および成熟期後期:9クローンの配列を決定した。基質形成期にアメロゲニンの遺伝子発現が認められたことは、この方法の信頼性を反映していると考えられた。配列を決定した遺伝子の中で興味深いものとして、次のような遺伝子とホモロジー(%)の高いクローンが挙げられる(昨年報告したもを除く)。基質形成期:カドヘリン関連腫瘍抑制遺伝子(69%)、タイプVIコラーゲン(82%)、ファーチリンα(72%)、グランザイムF(64%)、ゴリアスタンパク質(90%)、成熟期前期:プロテイン4.1(83%)、膜コート因子(66%)、成熟期後期:染色体分離タンパク質(91%)、M6P受容体(64%)、ERCC2(68%)。このうちゴリアスタンパク質のmRNAの発現をin situハイブリダイゼーションで確認し、成熟期エナメル芽細胞に豊富に存在していることを明らかにした。また、in situハイブリダイゼーション法を用い、フェリチンH,L鎖mRNAも基質形成期のエナメル芽細胞層に発現していることを明らかにした(Miyazaki et al.1998in press)。