定量的PCR法による黄色ブドウ球菌の薬剤耐性度の検討

Research Project

Project/Area Number	08877353
Research Category	Grant-in-Aid for Exploratory Research
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Laboratory medicine
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	木戸隆宏京都大学, 医療技術短期大学部, 助手 (60234308)
Project Period (FY)	1996 – 1997
Project Status	Completed (Fiscal Year 1997)
Budget Amount *help	¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000) Fiscal Year 1997: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000) Fiscal Year 1996: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Keywords	PCR / 薬剤耐性 / インターカレーション / RT-PCR / RNA定量 / MRSA / MIC
Research Abstract	多剤耐性菌であるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)の耐性機序に関与すると言われるタンパク質PBP-2'をコードするmecA遺伝子RNAを精度良く定量分析し、薬剤耐性度(MIC)との関係を明らかにする目的で以下の検討を行った。 1.RNA抽出条件の検討黄色ブドウ球菌の溶菌はリゾスタフィンによる前処理でより効果的になった。従来法であるプロテイナーゼK/SDS法に代わる磁気ビーズによる吸着法は操作も簡便で収量も満足すべきものであった。しかし、回収サンプルへのDNAの持ち込みが多かった。これは、黄色ブドウ球菌の遺伝子DNAが環状構造をとっているためと考えられた。逆転写反応からcDNAの増幅(RT-PCR)によるRNAの定量のために、この持ち込みDNAの除去について検討した。デオキシヌクレアーゼ処理では効果が認められなかったが、フェノール/クロロホルム処理で完全に持ち込みDNAを除去することが出来た。これらの方法により、処理時間を従来の約半分に短縮することができ、臨床検査に必須である多検体処理に適応可能と考えられた。 2.逆転写反応およびインターカレーションモニタリング(IM)-PCR法の至適条件の検討 IM-PCRの反応条件はプライマーの配列によって、ブランク値の高低を含めて微妙に異なり、多分に試行錯誤的ではあったが、種々検討した結果、低ブランク値の条件を設計することが可能となった。 3.薬剤耐性因子RNA発現量の測定 mecAをはじめ現在知られている薬剤耐性に関与すると言われるいくつかの遺伝子RNA発現量を測定した。発現量は株によって異なり、一定なものではなかった。以上のことから、これらのRNAを定量することによって、薬剤耐性の新たな指標をつくることが可能であると示唆された。