スクアレン合成酵素の大腸菌における大量発現と簡便な精製法の確立結晶化をめざして

Research Project

Project/Area Number	08878085
Research Category	Grant-in-Aid for Exploratory Research
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Bioorganic chemistry
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	畑信吾京都大学, 農学部, 助教授 (40238001)
Project Period (FY)	1996
Project Status	Completed (Fiscal Year 1996)
Budget Amount *help	¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000) Fiscal Year 1996: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Keywords	イネ / トウモロコシ / ダイズ / cDNAクローニング / pETシステム
Research Abstract	すでに解析が終了した双子葉植物シロイヌナズナのスクアレン合成酵素cDNAをプローブとして、やはり双子葉植物であるダイズのほか、単子葉植物であるイネとトウモロコシからも本酵素の完全長cDNAを単離できた。塩基配列を決定した結果、単子葉植物の本酵素アミノ酸配列は、双子葉植物のものと似かよっているが少し短いことが判明した。これらのアミノ酸配列をもとに酵母からヒトに至る真核生物における本酵素の進化系統樹を描かせたところ、植物の本酵素は動物や酵母とは別個のクラスターを形成し、そのなかでも単子葉植物と双子葉植物の酵素は異なるサブグループを形成した。サザンブロッティングの結果、イネのゲノムはハプロイドあたり本酵素遺伝子を1コピー有することが明らかになった。ノーザンブロッティングの結果、イネの本酵素mRNAは細胞増殖の盛んな器官に比較的多く発現し、乾燥ストレスやアブシジン酸処理で誘導された。また、黄化葉に赤色光もしくは青色光を照射すると、光の波長にもかかわらず、mRNAレベルは低下した。(以上をまとめて日本植物生理学会1997年度年会で発表予定。また論文投稿中。) ダイズ(植物)と以前に単離していたマウス(動物)の本酵素cDNAを代表的な実験材料としてpET32システムに組込み、製造元であるNovagen社のプロトコールに従って大腸菌BL21(DE3)で発現させることを試みた。しかし現在までのところ、本酵素を高レベルで発現するには至っていない。組換え部位の塩基配列より、ベクターの構築に問題がないことは確認した。今後はさらに細かく実験条件を検討し、本酵素の大量発現と精製に結びつけたい。