触媒機能を有するディノボ人工タンパク質の創製は可能か?

• Project/Area Number: 08878087
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Bioorganic chemistry
• Research Institution: Kyushu University (1997-1998); Kyushu Institute of Technology (1996)
• Principal Investigator: 西野 憲和 九州大学, 有機化学基礎研究センター, 教授 (40145165)
• Project Period (FY): 1996 – 1998
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1998)
• Budget Amount: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 1998: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000); Fiscal Year 1997: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000); Fiscal Year 1996: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
• Keywords: 加水分解活性 / ペルオキシダーゼ活性 / 人工タンパク質 / 触媒機能 / 酵素モデル / ポルフィリン / ディノボ設計 / モルテングロビュール / フラビン / ポリフィリン / 4α-ヘリックスバンドル構造

Research Abstract

4本のα-へリックス鎖を束ねた4α-へリックスバンドル構造体の4本のα-へリックスをつなぐ2つのループ部分に1組ずつのグルタミン酸とヒスチジンを配置した人工タンパク質を合成し、この立体構造および加水分解活性を評価した。2個のカルボキシル基と2個のイミダゾールがこの人工タンパクが4α-ヘリックスバンドルを形成するときにバンドル上面に集まり、触媒活性を発揮できるように設計した。合成した1本鎖63-ペプチド(63-HEHE)はCD測定の結果リン酸緩衝液中でα-ヘリックス構造となった。Zn^<2+>イオン添加によってヘリックス性が変化することから、バンドル上面の触媒活性部位に金属イオンを結合することが可能であることがわかった。さらに63-HEHEは緩衝液中p-ニトロフェニルエステルを加水分解し、疎水性の長鎖アルキル基を持つ基質に対して高活性を示した。
また、人工ペルオキシダーゼを目標とした人工タンパク質の合成と評価を行った。この人工タンパク質はβ構造とα-ヘリックスとを交互に並べたβαβα構造体であり、はじめのβ構造部分に鉄ポルフィリンを配し、α-ヘリックス部分にヒスチジンを配することによってペルオキシダーゼ活性を持つよう設計したものである。合成はオキシム樹脂固相合成・セグメント縮合法によって行った。ペルオキシダーゼ活性の評価は、酸化剤として過酸化水素、クメンハイドロパーオキサイド、t-ブチルハイドロパーオキサイド、リノール酸過酸化物を用い、ポルフィリンによってMCDPが酸化されることによる可視吸光を測定することによって行った。リノール酸過酸化物を酸化剤として用いた場合が最も活性が高い結果が得られた。細長く疎水性の高いリノール酸過酸化物が活性部位を含む内部疎水場に最も入りやすかったためと考えられる。

Research Products

• [Publications] Kin-ya Tomizaki, Daisuke Oka, Yoshikazu Kakimoto, and Norikazu Nishino: "Catalytic activities of an artificial protein with designed loops" Peptides Proceedings of the 1st International Peptide Symposium. (in press). (1999)
• [Publications] S.Kunugi: "N-D-Biotinyl-7-amino-4-methylcoumarin as a novel fluorigenic substrate for the determination of biotinidase activity" Chem.Lett.1997・2. 391-392 (1997)
• [Publications] 西野憲和: "機能性原子団を装置した擬タンパク質のディノボ設計" 生物物理. 37・4. 161-164 (1997)
• [Publications] K.Tomizaki: "Catalytic activities of an artificial protein with designed loops" Peptides,the Proceedings of the First International Peptide Symposium. 1・1(in press). (1998)
• [Publications] K.Tomizaki: "Substrate specificities of artificial flavo-enzymes" Peptides,the Proceedings of the First International Peptide Symposium. 1・1(in press). (1998)
• [Publications] K.Kaneko: "Catalytic activities of an artificial heme enzyme" Peptides,the Proceedings of the First International Peptide Symposium. 1・1(in press). (1998)
• [Publications] Y.Tanaka,K.Nagamoto,H.Sasaki,T.Fujimoto,N.Nishino,M.Oka: "Four α-Helix Bundle Structure Built with Alternating D-and L-Segments." Tetrahedron Lett.37. 881-884 (1996)
• [Publications] Y.Tanaka,H.Akisada,T.Fujimoto,N.Nishino: "Fluorescence Energy Transfer to Tailed Acridine Oranges from Pyrene Excimer" Chem.Lett.1996. 135-136 (1996)
• [Publications] N.Nishino,T.Murata,K.Kaneko,T.Uchida,T.Fujimoto: "Four α-Helix Bundle Structure Accommodating a Pair of Porphirin Rings" Peptides 1996,Proceedings of 24th Eurorpean Peptide Symposium. 1996(in press). (1997)
• [Publications] N.Nishino,H.Sasaki,K.Kaneko,T.Uchida,T.Fujimoto: "Design of βαβα-Structure of Polypeptide with Pyrene,Flavin,and Porphrin Functions" Peptides 1996,Proceedings of 24th Eurorpean Peptide Symposium. 1996(in press). (1997)
• [Publications] H.Mihara,J.Hayashida,H.Hasegawa,H.I.Ogawa,T.Fujimoto,N.Nishino: "A Pair of Pyrene Groups as a Comformational Probe for Antiparallel β-Sheet Structure Formed in Cyclic Peptides." J.Chem.Soc.Perkin Trans.2. 1997(in press). (1997)