新しいコレステロールプローブによる細胞機能の解析

Research Project

Project/Area Number	08878121
Research Category	Grant-in-Aid for Exploratory Research
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Cell biology
Research Institution	Gunma University
Principal Investigator	藤本豊士群馬大学, 医学部, 教授 (50115929)
Project Period (FY)	1996 – 1997
Project Status	Completed (Fiscal Year 1997)
Budget Amount *help	¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000) Fiscal Year 1997: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000) Fiscal Year 1996: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Keywords	コレステロール / 細胞膜 / カベオラ / キャップ形成 / 細菌毒素 / 培養細胞
Research Abstract	コレステロールに特異的に結合する性質を持つθ毒素を部分分解し、さらにビオチン化したプローブ(BCθ)を用い、培養上皮細胞、リンパ球の細胞膜におけるコレステロール分付、さらに未固定の細胞で細胞膜のコレステロールを架橋した際の挙動について検索した。固定した上皮細胞ではBCθは細胞膜全域に結合した。この結合はフィリピン、ジギトニンなどで阻害されコレステロール特異的であることが確かめられた。無固定の上皮細胞に氷温でBCθを作用、蛍光などで標識したアビジンで可視化すると、標識は細胞表面にほぼ一定の密度で結合した。BCθと標識アビジンを結合させた後に37℃に浸漬すると、標識はカベオラ付近の細胞膜に集中し、少なくともその一部はカベオラから取り込まれてエンドソームに到達した。一方、リンパ球では、氷温で作用させたBCθは細胞表面にほぼ一定の密度で結合したが、BCθと標識アビジンを結合させた後に37℃に浸漬すると、標識はキャップを形成した。キャップ形成はサイトカラシンやアジ化ナトリウムで阻害されたが、コルヒチンでは阻害されなかった。今回の実験によりBCθで標識される細胞膜コレステロール分子は膜全域にほぼ均一に分布するが、架橋の結果、カベオラをもつ細胞ではカベオラに集中し、またカベオラのないリンパ球ではキャップを形成することが明らかになった。この分布変化の様式はGPI結合型膜蛋白質、糖脂質、スフィンゴミエリンの場合と同じである。