ノンヘム型の2価鉄イオンを含む-2原子酸素添加酵素の超高分解能X線結晶構造解析
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09235210
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Nagaoka University of Technology |
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Principal Investigator |
三井 幸雄 長岡技術科学大学, 工学部, 教授 (40012637)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
千田 俊哉 長岡技術科学大学, 工学部, 助手 (30272868)
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| Project Period (FY) |
1997
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1997)
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| Budget Amount *help |
¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Fiscal Year 1997: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
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| Keywords | ノンヘム鉄 / 2原子酸素添加酵素 / ジオキシゲナーゼ / X線解析 / 蛋白結晶学 / 蛋白精造 / ビフェニル分解代謝系 / PCB分解代謝系 |
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| Research Abstract |
本研究では、活性中心の鉄イオンの周囲の電子密度(特に電子の局在化の様子)を1.2Å以上の高分解能で可視化する事を目的としている。本年度は、まず第一に高分解のX線回折像を与える良質の結晶の作成を、精製条件の再検討も含めて行った。具体的には精製段階においてイオン交換カラムの容量等、使用法を最適化することで、以前に比べて純度の高い蛋白質サンプルを得ることに成功した。更に、結晶化条件に関しても、より大粒の結晶を得るために、再検討を行った。その結果、現在までのHangind drop法からBatch法に変更することで、より大粒の結晶を得ることに成功した。以上に加え、高分解能回折データを測定するには、X線による結晶の損傷を最低限に押さえる必要がある。このためには、超低温での回折強度測定が効果的と考え、超低温(100K)での回折強度測定の為の条件検討を行った。その結果、BphC酵素の結果を30%のエチレングリコールを含む標準緩衝液(BphC酵素の結晶の保存溶液)に浸すことで、良好なデータ測定が可能なことを見出した。
また、活性型(活性中心の鉄イオンが2価の状態)での構造解析を行うためには、無酸素的に結晶化を行い、活性中心の鉄イオンの酸化を防ぐ必要がある。このために、高度に酸素を取り除いた状態で結晶化を行うための装置を設計し、これを作成した。
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Report
(1 results)
Research Products
(2 results)
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[Publications] Nandhagopal,N., Senda,T., Hatta,T., Yamada,A., Masai,E., Fukuda,M. & Mitsui,Y.: "Three-dimensional structure of microbial 2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienole acid (HPDA) hydrolase (BphD enzyme) from Rhodococcus sp. stratin RHA I,in the PCB degradation pathway." Prot.Japan Acad.Series B. 73. 154-157 (1997)
