分裂酵母複製開始点に結合する核蛋白質複合体

Research Project

Project/Area Number	09263208
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	升片久夫大阪大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (00199689)
Project Period (FY)	1997
Project Status	Completed (Fiscal Year 1997)
Budget Amount *help	¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000) Fiscal Year 1997: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Keywords	真核生物複製開始必須配列 / 分裂酵母 / 複製開始複合体 / 細胞周期 / 免疫沈降法
Research Abstract	分裂酵母染色体DNAの複製開始とその制御機構を明らかにするために、複製開始蛋白と複製開始点を含む細胞核内構造に関する以下の成果を得た。 1.分裂酵母第2染色体上で実際に複製開始点として機能する領域を自律複製断片(ARS2004断片)として分離し、アデニンが連続する配列が繰り返し存在することが複製開始に必須であることを発見した。 2.細胞を穏やかに破壊し染色体DNAを含む不溶性画分と可溶性画分に分画する方法を用い、出芽酵母複製開始因子ORC(origin recognition complex)サブユニットの分裂酵母ホモログであるOrp1蛋白は細胞周期を通じて染色体に結合しているのに対し、MCM(minichromosome maintenance)ファミリーに属するMis5蛋白、Nda1蛋白はG1/S期にのみ染色体DNAに結合することを示した。 3.間接蛍光抗体法により,Mis5蛋白質は細胞周期を通じて細胞核内に局在するが、G1/S期にのみ染色体上に特異的fociとして検出された。よって、Mis5蛋白は細胞周期特異的に染色体上の特定の領域上に集約的な複合体として局在することが示唆された。 4.ホルマリン固定した細胞より免疫沈降法を用いてOrp1-DNA複合体を回収することにより、複製開始点が特異的に検出された。分裂酵母細胞内でORCが複製開始点特異的に結合していることが示唆された。 5.可溶化した細胞抽出液より免疫沈降法により回収したOrp1蛋白質(ORC複合体)が、試験管内で分裂酵母複製開始領域DNAに特異的に結合することを発見した。