| Project/Area Number |
09269207
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
松永 司 金沢大学, 薬学部, 助教授 (60192340)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石垣 靖人 金沢大学, 薬学部, 助手 (20232275)
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| Project Period (FY) |
1997
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1997)
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| Budget Amount *help |
¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
Fiscal Year 1997: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
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| Keywords | ヌクレオチド除去修復 / 色素性乾皮症 / エンドヌクレアーゼ / ミスマッチ修復 / ノックアウトマウス / 遺伝子不安定性 / Two-hybridシステム / モノクローナル抗体 |
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| Research Abstract |
XPGとXPE-ERCC1タンパクは、ヌクレオチド除去修復(NER)機構においてそれぞれ3′,5′切断酵素として働くが、本来はバブルやループなどの特殊なDNA構造を基質とするエンドヌクレアーゼである。これらの遺伝子(XPGあるいはERCC1)を欠損したマウスはいづれも成長阻害を示し、離乳前にすべて死亡する。本研究では、この両エンドヌクレアーゼのNER機構以外での機能に着目し、その本体を明らかにすることを目的とした。本年度の主な研究成果は以下のとおりである。
1.バキュロウィルス/昆虫細胞系を用いてXPGタンパクを高発現させ、3種のカラムステップにより精製した。様々なDNA基質を用いて切断活性を調べたところ、1-3ntのバブル(塩基ミスマッチ)型DNA基質に対しても切断活性を示すことが明らかとなった。また、3ntのループ(IDミスマッチ)型DNA基質に対する切断活性も認められ、酵素活性的にはDNA中に生じたミスマッチ部分に対してXPGが働き得る可能性が示唆された。
2.放医研の塩見らによって樹立されたxpgノックアウトマウス胎児由来細胞を継代培養したところ、最初は正常あるいはヘテロ細胞より増殖率が低かったものの、途中から急激に増殖率が上昇し、正常やヘテロ由来細胞よりも早く株化した。4継代ごとに細胞よりDNAを抽出して、マイクロサテライト解析を行ったところ、調べた8種類のプライマーのうち2種類で継代に伴ったバンドパターンの変化が観察された。
3.酵母のTwo-hybridシステムを用いてXPGタンパクと相互作用する可能性のある4つのクローンを分離した。現在、塩基配列の決定、ならびに各相互作用についてのin vitroでの確認を行っている。
4.MBP-XPG、あるいはMBP-ERCC1を抗原としてマウスに免疫を行い、これまでにXPGタンパクに対するモノクローナル抗体を4種類樹立した。
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