ミスマッチ認識および修復過程の生化学的研究

• Project/Area Number: 09269220
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 秋山 昌広 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (80273837)
• Project Period (FY): 1997
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1997)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 1997: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: ミスマッチ修復 / 枯草菌 / 自然突然変異

Research Abstract

枯草菌ゲノムプロジェクトによりmutS遺伝子が見いだされたので、PCR法によりDNA断片を増幅しmutS遺伝子をクローン化した。クローン化したmutS遺伝子は全塩基配列を決定し、PCRエラーを含まないことを確認した。枯草菌mutS遺伝子をT7プロモーターの制御下におき、大腸菌内で分子量97,500ダルトンの枯草菌MutS蛋白質を大量に発現させた。その遺伝子産物をリゾチーム処理、硫安沈殿、Heparin Sepharoseカラム、MonoQカラムによってほぼ単一標品に精製した。枯草菌MutS蛋白質を精製するためのアッセイ系としては、^<32>Pでラベルしたミスペアを含む二本鎖DNA基質(Heteroduplex)によるゲルモビリティシフト法を用いた。
枯草菌MutS蛋白質によるミスペア認識の特異性を解析するため、精製標品を用いて枯草菌MutS蛋白質はHeteroduplexに特異的に結合することを明らかにした。その中でも特にトランジション型の変異、一部のトランスバ-ジョン型の変異、さらに1〜2塩基のループ構造等のミスペアを特異的に認識する活性をもっていた。MgCl_2非存在下でもミスペアを認識することができるが、ATP存在下ではその活性はかなり低下した。また、枯草菌MutS蛋白質とHeteroduplexとの相互作用を解析するためにATPase活性を測定した。その結果、Heteroduplex、ミスペアを含まない二本鎖DNA基質(Homoduplex)、一本鎖DNA基質、DNA基質なしの順でATPase活性が低下した。