| Project/Area Number |
09272203
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
西垣 功一 埼玉大学, 工学部, 助教授 (10107378)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 美穂 埼玉大学, 工学部, 助手 (60222064)
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| Project Period (FY) |
1997
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1997)
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| Budget Amount *help |
¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
Fiscal Year 1997: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
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| Keywords | ランダムPCR / ショットガン法 / PCRリレー / ヒトゲノム計画 / ゲノムシーケンシング / 大腸菌ゲノム / ヒット確信度 / 迅速ROSOR法 |
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| Research Abstract |
(1)第一段階(ランダムPCR過程)から第二段階(PCRリレー過程)への切り換え問題
シーケンシングの効率を議論する際に、冗長度(R)で評価するとき、PCRリレーの段階は方法論から、R=2であるが、手間がかかり、実効的にR=4〜6である。ショットガン法のような完全ランダム過程でゲノム全体の配列決定を考え、全体のα(0≦α≦1)だけ配列決定したときのシミュレーション結果から、[ R=-2.1log(1-α)+0.5]が導かれ、さらに、[α=1-10^<(0.5-c)/2.1>]で効率最高となることが示された(eは第二段での単位作業量)。e=4とすると、α=0.978、また、e=10とするとα=0.99997となり、いずれにしろ、かなり深くまで、第一段階を追求することが全体の効率を高めることにつながることが示された。
(2)大腸菌ゲノムでのシミュレーション結果がヒトゲノムにまで適用できるか否かの問題
この問題はゲノムサイズNと配列決定用DNA断片サイズnと配列決定割合αの関数として、コンティグ数(Ct)や冗長度(R)を求めた。その結果、Ct/NはNに殆ど依存しないが、nへは依存することがしめされた。従って、ランダムシーケンシングを採用する限り、実質的に作業量はゲノムサイズに比例するに過ぎないことがわかった。
ランダムPCRの'非ランダム性'評価
ランダムPCRはプライマーの塩基配列によって、選びあげるDNA断片を操作しえて、ある種の計画性(ヒット確信度φ)を付与する。計算結果、φが数%から数10%、ランダムから有意にずれていることが明らかになった。
(4)ランダムPCRによる大腸菌ゲノムシーケンシングシミュレーションとランダムPCRの実践
もとはPASCALで開発したが、計算機資源環境の変化に対応して、より汎用性の高いVisual Basicに換えて作成を続けている。より高速なものにするために、「相補性要件」を重視し、それにより一次スクリーニングすることを基本とした。また、大腸菌ゲノムに対して、新たに灼く50試料のランダムPCR/TGGE解析を行い、これまでの研究成果を支持する結果を得、信頼性を高めた。同時に、ランダムPCR用プライマーの5'末端ラベル法を開発した。
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