| Project/Area Number |
09272218
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
和田 守正 九州大学, 医学部, 助教授 (20220965)
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| Project Period (FY) |
1997
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1997)
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| Budget Amount *help |
¥3,800,000 (Direct Cost: ¥3,800,000)
Fiscal Year 1997: ¥3,800,000 (Direct Cost: ¥3,800,000)
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| Keywords | 酵母人工染色体 / YAC導入 / MDR1 / 発現クローニング / 位置効果 / DNAメチル化 / 薬剤耐性 / エクソントラップ法 |
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| Research Abstract |
ヒトMDR遺伝子領域をモデルクローンに用いて、導入YACの動態、導入効率を解析し、YAC導入法の再現性を規定しうる因子は何かを検討するとともに、YAC導入法を応用して、実際に発現クローニングを試みた。その結果、
1.MDR1のcDNAを用いた導入実験によると、薬剤耐性トランスフェクタント/Neo^rトランスフェクタントの効率は0.06%である。これに対し、YACクローンを用いた場合、Neo^rトランスフェクタント全てが耐性を獲得していることを示し、cDNAを用いた場合に見られる挿入位置による発現量の不均一性を回避できることを示唆した。
2.導入YACの動態の解析、5aza-CdR処理実験により、この挿入位置非依存的発現は、導入DNAのメチル化からの回避によることを明らかにした。
3.このYAC導入法を発現クローニングに応用して、新規耐性関連遺伝子の探索を試みた。MDR1周辺の300kb及び850kbYACの導入細胞につき、MDR1遺伝子産物と薬剤感受性の相関を検討した結果、この領域の新規耐性関連遺伝子の存在が示唆された。さらに、エクソントラップ法によりこの領域の60エクソンを単離した。このうち膜タンパク質をコードする遺伝子が6種類存在し、薬剤トランスポータとして薬剤感受性に関与していることが示唆された。
以上の成果からYAC導入による発現系の有用性が示されたが、発現クローニングへ応用するためには導入効率を改善し、挿入位置非依存的発現の一般性を検討する必要がある。従って、従来の成果をさらに発展させ広範なシステムに効率よく適用させるために、今後1.YACを環状化した後導入する方法を開発して、YAC導入時の専断力を避け、効率を上昇させる、2.メチル化による導入遺伝子の選択的発現の一般性を他の遺伝子クローンについて検討する、ことなどが必要であると考えられる。
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