| Project/Area Number |
09680769
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Research Field |
Neurochemistry/Neuropharmacology
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
小鹿 幸生 名古屋市立大学, 医学部, 助教授 (20177223)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森下 学 名古屋市立大学, 医学部, 研究員
継 泰城 名古屋市立大学, 医学部, 助手 (40285218)
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| Project Period (FY) |
1997 – 1999
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1999)
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| Budget Amount *help |
¥3,100,000 (Direct Cost: ¥3,100,000)
Fiscal Year 1999: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000)
Fiscal Year 1998: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000)
Fiscal Year 1997: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
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| Keywords | 神経ペプチド / HCNP / 海馬由来神経刺激因子 / HCNP受容体 / Radiolabeled Receptor Assay / コリン作動性神経 / 中枢神経 / 受容体 / 海部由来神経刺激因子 / RRA / 中枢神経系 / Kd / 活性中心 |
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| Research Abstract |
1.Radiolabeled receptor assey(RRA)系の確立
ラット脳組織と氷冷0.32Mショ糖溶液中でホモジェナイズ後、遠心法でP1(核画分)、P2(mitochondria-synaptosome画分)、P3(microsome画分)及び可溶性画分に分離した。ラットHCNPをBolton-Hunter法でヨード化し、0.3%BSAを含むRRA溶液(50mM Tris-HCL,pH7.6)で希釈して標識リガンド(^<125>I-HCNP)とした。200μlの画分に0.342MBqの^<125>I-HCNPを50μl、RRA溶液または非標識リガンド溶液(50μl)を加え300μlとし、30℃で30分インキューベーションした。氷冷RRA溶液1mlを加えWhatman GF/Fフィルターを用い非結合を除去し、標識リガンドの結合が非標識リガンド(1nmol/assy)で置換された結合を特異的結合とした。可溶性成分のRRAは反応後、30%の氷冷PEG600を加え遠心法で非結合リガンドを除去して測定した。
2.HCNP受容体の性質
^<125>I-HCNPの結合成分は、(1)P1画分に9.0%、P2画分に74.9%、P3画分に14.9%、可溶性画分に1.2%分画され、(2)大脳皮質に多く、小脳や線条体には少ない。また、(3)^<125>I-HCNPの受容体への結合は濃度依存性に増加し50nM近傍で飽和した。(Bmaxは9.4nM/mg,Kdは3.53×10^<-11>M)。(4)HCNP受容体は高親和性の単一受容体である。(5)^<125>I-HCNPはそのC末端近傍が受容体への結合する。(6)HCNP受容体はCHAPSで可溶化される。
3.HCNP受容体精製における問題点とその解決法
(1)HCNP受容体は不安定で凍結下でも長期保存が困難。(2)上記RRA系のBacl groundを低下し、assay系を縮小し使用蛋白量を減量するのに、標識リガンドの純度を上げることやGF/Fフィルターを0.3%免疫グロブリンで前処置することが効果的であった。
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