精巣機能を制御する新しい細胞外マトリックスタンパクの検索,二次元電気泳動を用いたタンパクの分離・同定

Research Project

Project/Area Number	09770013
Research Category	Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	General anatomy (including Histology/Embryology)
Research Institution	Yokohama City University
Principal Investigator	矢間太横浜市立大学, 医学部, 助手 (00254160)
Project Period (FY)	1997 – 1998
Project Status	Completed (Fiscal Year 1998)
Budget Amount *help	¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000) Fiscal Year 1998: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000) Fiscal Year 1997: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
Keywords	ラット / 精巣 / 細胞外マトリックス / IV型コラーゲン / 二次元電気泳動 / アミノ酸シークエンス
Research Abstract	ラット精細管細胞外マトリックス(以下ST-ECM)成分を生化学的に分析し、ここから新しいECM成分を同定し、これが精巣機能にどの様な影響を及ぼすのかを解明するために実験を進めている。現在私たちはST-ECMを単離し、この8モル尿素溶液可溶化分画を二次元電気泳動によって、分子量2〜20万の範囲で20以上のECM成分に分離している。この内分子量約18万、pl5.0のタンパクを回収し、アミノ酸シークエンスを行なった結果、このタンパクがIV型コラーゲンα5鎖(ヒト)とホモロジーがあることを確認した。一方私たちは精細管基底層(testicular lamina propria)のECM構成層を5層であると定義し、今までには存在が確認されていなかったECM成分の確認、今までに報告されていた局在パタンとの相違を免疫電子顕微鏡法によって明らかにし、これを報告した。さらに、ST-ECMをマウスに免疫し、これより数種のモノクローナル抗体を得た。蛍光抗体法によってST-ECMのみを特異的に認識する抗体をスクリーニングした。このうちの1つである13H12抗体はWestern blottingによっても精巣特異的であることが確認され、ST-ECMの8モル尿素溶液可溶化分画の27-kDタンパクを認識することを確認した。SDS-PAGEによって27-kDタンパクを分離し、ゲル切り出しによって回収・濃縮した。次いで27-kDタンパクをCleveland法に従ってV8 protease digestionを行なった後に、PVDF膜に転写した。得られた数本のV8 digested 27-kDタンパクフラグメントについてアミノ酸シークエンス分析を行なった結果、Hypothetical protein 23.2-kD(EMBL accession No.006392)とHypothetical protein 24.2-kD(EMBL accession No.Q50509)にそれぞれ36.842%、46.145%のhomologyを示した。この結果より、27-kDタンパクは新規のECMタンパクであることが強く示唆され、このアミノ酸シークエンス分析のデータを手がかりに、遺伝子工学的な解析に着手する予定である。