| Project/Area Number |
09770637
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Dermatology
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
花川 靖 愛媛大学, 医学部・附属病院, 助手 (90284398)
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| Project Period (FY) |
1997 – 1998
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1998)
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| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 1998: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000)
Fiscal Year 1997: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
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| Keywords | 劣性栄養障害型先天性表皮水疱症 / VII型コラーゲン / 表皮細胞 / 不死化 / アデノウイルスベクター |
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| Research Abstract |
劣性栄養障害型先天性表皮水庖症の患者より表皮ケラチノサイトを分離培養し、一部の細胞はSV40ウイルス遺伝子にて不死化を行った。外来遺伝子の発現実験として不死化細胞にリポフェクション法にてenhanced green fluorescent protein(EGFP)DNAを導入した。約10%の細胞でEGFPが陽性であった。また、正常ケラチノサイトにアデノウイルスベクターを用いてEGFPを導入した。ほぼ100%の細胞に陽性所見が認められた。一方、全長VII型コラーゲン遺伝子のN末端領域にflag tagを挿入し、eukalyotic expression vecterであるpcDNA3に組み込んだもの(pcDNA-F-COL7A1)とtagなしのもの(pcDNA-COL7A1)を精製しCOS7細胞ヘリポフェクションし、免疫蛍光染色及び蛋白を回収し、ウエスタンブロッティングを行った。LH7.2(抗VII型コラーゲン抗体)、抗flag抗体を用いた免疫蛍光染色にてLH7.2で陽性所見が得られたが抗flag抗体では陰性であった。N末端にtagを挿入すると蛋白作製に問題がある可能性が考えられた。しかし、ウエスタンブロッティングにてLH7.2にて目的のバンドが認められなかった。そこで、DNAの配列を確認したところDNAに変異、欠損が認められた。現在全長VII型コラーゲン遺伝子を再度作成中である。正常全長VII型コラーゲン遺伝子を確認後、劣性栄養障害型先天性表皮水疱症の患者由来の表皮ケラチノサイトに正常遺伝子を導入予定である。
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