| Project/Area Number |
09771262
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Obstetrics and gynecology
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
高木 靖 信州大学, 医学部, 助手 (00226755)
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| Project Period (FY) |
1997 – 1998
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1998)
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| Budget Amount *help |
¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
Fiscal Year 1998: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Fiscal Year 1997: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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| Keywords | 正常臍帯動脈 / アポトーシス関連因子 / TUNEL / bcl-2 / Western blotting / 老化関連因子 / PCR / テロメラーゼ活性 / 臍帯動脈平滑筋細胞 / 細胞周期調節因子 / cyclinE / p21 / p27 / PCNA / ウエスタンブロッティング法 / テロメレース |
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| Research Abstract |
本年度は昨年に引き続き臍帯の分化及び老化を分子レベルで解析した。特に臍帯の分化及び老化にアポトーシスが関与するか否かを調べた。アポトーシス関連因子bcl-2を組織レベル、タンパクレベル、遺伝子レベルで解析し、実際にアポトーシスが起きているかどうか検討した。bcl-2について組織レベルで解析を行い、TUNEL(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labelling)法を用いてアポトーシスを検出した結果、僅かにアポトーシスが検出されたが、臍帯の週齢別では変化が無かった。また患者の同意を得た上で得られた正常臍帯動脈をcell lysis buffer中にてホモジネートしてタンパク質を抽出し、各30μgをSDS-PAGEにて分離、Western blotting法にてニトロセルロースフィルターに移してbcl-2の抗体を反応させ、ECLキットを用いて蛍光反応によりタンパク質発現を解析したがbcl-2のタンパク質の量は、臍帯の各週齢別では変化が無かった。
次に臍帯の分化及び老化に老化関連因子であるテロメラーゼが関与するか否かを検討した。患者の同意を得た上で得られた正常臍帯動脈をcell lysis buffer中にてホモジネートしてタンパク質を抽出し、テロメラーゼアッセイを行った。抽出したタンパク質中のテロメラーゼはその3'末端にtelomeric repeatsという特定の配列を作るので、3'末端にtelomeric repeatsの配列を作らせ、telomerase productsはその3'末端にtelomeric repeatsの配列と、その配列に相補的なプライマーCX[5'-(CCCTTA)_3 CCCTAA-3']とdNTPを臍帯組織抽出液と混合し、PCRにて増幅、そのproductsを電気泳動にて検出した。その結果、各週齢の違った臍帯抽出したタンパク質では、各週齢でのテロメラーゼ活性の違いが見出せなかった。本課題全体を通じて、臍帯の発生ではその初期に、Cyclin Eが強く発現することを明らかにすることができた。
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