自己スプライシングにより生成する酵母VMA1エンドヌクレアーゼの結晶解析

• Project/Area Number: 09771942
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Physical pharmacy
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 水谷 隆太 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助手 (70272482)
• Project Period (FY): 1997 – 1998
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1998)
• Budget Amount: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000); Fiscal Year 1998: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 1997: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: プロトザイム / プロテインスプライシング / エンドヌクレアーゼ / インテイン / X線結晶構造解析

Research Abstract

酵母VMAl遺伝子がコードする一本鎖蛋白質は、液胞性ATPase触媒サブユニットを切り出し、中央部のDNAエンドヌクレアーゼ(Vmal derived endonuclease、以下VDE)を生成する。ポリペプチド鎖の切り出しと接続によるこの現象は、プロテインスプライシングと呼ばれており、自己触媒的に進行する。スプライシング反応の機構を三次元構造に基づいて明らかにすることを目的として、両端にスプライシングペプチド部分を付加したVDE(XA-VDE)のX線結晶構造解析を行った。大腸菌発現系によりXA-VDEを調製し、結晶化した。2人分解能までのX線回折強度データ(completeness97%)を測定し、分子置換法により得た初期モデルを結晶学的に精密化した。10〜2Å分解能においてR因子が0.203(R_<free>は0.264)まで精密化した。
XA-VDE結晶は野生型VDEの構造と同型であり、スプライシング活性を有するドメインIについては、そのrmsdが0.35人、エンドヌクレアーゼ活性に重要なドメインIIでは0.62人であった。N末端には付加したペプチド鎖に相当する電子密度が観察された。スプライシング反応に必須なHis362の側鎖が、切断されるペプチド結合の近傍に存在し、その反対側には変異を導入したAla284側鎖が位置している。C末端側4残基については相当する電子密度が得られず、MALDI-TOF質量分析によっても、Ala738以下を欠落していることを確認した。これは、スプライシング反応のステップでもあるAsn737の後での切断反応が進行した結果である。

Research Products

• [Publications] 水谷 隆太: "抗体の抗原特異性と三次元構造" 臨床免疫. 29・4. 490-495 (1997)