細胞はどのようにして変異型UDP-グルクロン酸転移酵素を選択的に排除するのか

Research Project

Project/Area Number	09780580
Research Category	Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Functional biochemistry
Research Institution	Himeji Institute of Technology
Principal Investigator	衣斐義一姫路工業大学, 理学部, 助手 (60232980)
Project Period (FY)	1998
Project Status	Completed (Fiscal Year 1998)
Budget Amount *help	¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000) Fiscal Year 1998: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000) Fiscal Year 1997: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
Keywords	UDP-グルクロン酸転移酵素 / 高ビリルビン血症 / 遺伝病 / 蛋白分解 / プロテアソーム / 薬物代謝 / 細胞内蛋白分解
Research Abstract	(1)ヒト肝mRNAを逆転写したものを鋳型にし、ヒトUGT1A1に特異的なプライマーを用いてcDNAを増幅した。(2)Crigler-Najjar症候群を発症する患者より得られた変異型UGT1A1の配列を元に、部位特異的変異導入法により次に示す4種の変異を導入した。重症の高ビリルビン血症を示すタイプIに属する変異Q357End(357番目のグルタミンのコドンが終始コドンに変化)、K417i(417番目のリジンのコドンに1塩基が挿入されフレームシフトが生じ11残基の関係ないアミノ酸が付加される)、およびK437End(437番目のリジンのコドンが終始コドンに変化)、また比較的軽症のタイブIIに属する変異L15R(15番目のロイシンがアルギニンに変化しシグナル配列が異常になる)。(3)これらをpUCDSRαに組み込み発現ベクターを構築し、リン酸カルシウム法によりCOS細胞に導入した。(4)正常型UGT1A1は分子量が約52,000で小胞体膜の内腔側に局在し糖鎖で修飾されており、約14時間の半減期で分解された。またビリルビンに対するグルクロン酸抱合活性を持っていた。(5)Q357End、K417i、およびK437Endはすべて小胞体内腔に局在し膜と結合していなかったが、糖鎖修飾は受けていた。これら3種の変異体の分解半減期は正常型とほぼ同じであったが、ビリルビンに対するグルクロン酸抱合活性を持っていなかった。(6)L15Rは分子量が約51,000で、約40分の半減期で速やかに分解された。さらにL15Rは局在が異常で、小胞体膜の細胞質側にゆるく結合した状態あるいは細胞質に存在する事が分かった。細胞をラクタシスチンなどで処理するとL15Rの速やかな分解が抑制されることより、L15Rは本来の小胞体に局在しないため細胞質のプロテアソームにより速やかに分解される事が分った。