蛍光蛋白質発現法および光学的手法による超高感度インスリン検出法の開発

Research Project

Project/Area Number	09877009
Research Category	Grant-in-Aid for Exploratory Research
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	General physiology
Research Institution	Hamamatsu University School of Medicine
Principal Investigator	櫻井孝司浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 助手 (50283362)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	寺川進浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 教授 (50014246)
Project Period (FY)	1997 – 1998
Project Status	Completed (Fiscal Year 1998)
Budget Amount *help	¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000) Fiscal Year 1998: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000) Fiscal Year 1997: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Keywords	膵β細胞 / 副腎随質クロマフィン細胞 / 海馬神経細胞 / 共焦点レーザー顕微鏡 / エキソサイトーシス / 量子的放出 / ケージドグルタミン酸 / レーザーフォトリシス / Nipkow Disk / キナクリン
Research Abstract	膵β細胞β顆粒内へGFP(green fluorescence protein)遺伝子を組込んだインスリン遺伝子の導入法、および分泌顆粒内のGFP蛍光分子の高感度検出法の開発を行った。その結果、単一分泌顆粒において、顆粒内物質と共放出される蛍光分子の特異的標識、ならびにビデオレートを超える高速・高感度追跡の技術開発に成功した。インスリン-GFPのβ顆粒内の特異的発現には至らなかったが、分泌顆粒への特異的な蛍光標識法の代替手段が開発できた。まず、内分泌研究のモデル細胞である培養ウシ副腎随質クロマフィン細胞に蛍光色素キナクリンを負荷し、488nmで励起した蛍光をNipkowディスク走査型共焦点レーザー顕微鏡およびデジタル画像処理装置で解析を行った。細胞膜近房には分泌顆粒が個々の高輝度蛍光塊として観察され、電気や脱分極刺激に応じた開口放出反応により、カテコールアミンと蛍光分子の共放出が確認された。これにより一度の開口放出反応による顆粒内容物の放出率を定量した結果、部分放出様式が存在していることが明らかになった。次に、ケイジド神経伝達物質とパルスレーザーを用いて培養海馬神経細胞の局所刺激を行った。この刺激の際にシナプス小胞の放出マーカーである蛍光色素FM1-43を細胞外溶液に存在させておくと、神経終末額域のシナプス小胞集団が高効率に蛍光標識されることが見いだされた。標識された小胞集団は、シナプス後細胞のグルタミン酸受容体が高く発現している部位と空間的な一致がみられ、再刺激による急速な再放出反応を示した。従って、グルタミン酸を含有するシナプス小胞の蛍光標識および伝達物質放出のシナプス単位での定量解析が可能になった。本研究によって開発された画像解析法や蛍光標識法は、膵β細胞におけるインスリン放出のみならず、神経終末よりの伝達物質放出の超高感度検出法として発展可能である。さらに、インスリン分泌異常や神経細胞死の分子機構を解明する上で有用な方法であることも示された。