点頭てんかんの発症機序に関する実験的研究-CRHcDNAの脳内発現によるモデル動物の作成-

• Project/Area Number: 09877149
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Pediatrics
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 太田 秀臣 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (10112814)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡藤 隆夫 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (40266599) ; 南谷 幹之 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (00229775) ; 松島 宏 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (70190460)
• Project Period (FY): 1997 – 1998
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1998)
• Budget Amount: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000); Fiscal Year 1998: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 1997: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
• Keywords: 点頭てんかん / モデル動物 / 副腎皮質刺激ホルモン放出因子 / 遺伝子導入

Research Abstract

点頭てんかんは乳児期にみられる最も悪性のてんかん発作であるが、その成因や有効とされるACTH療法の作用機序に関しては不明である。近年、点頭てんかんは特異的な年齢において、脳内での副腎皮質刺激ホルモン放出因子(CRH)の過剰発現による神経系の異常興奮に基づくとの仮説が報告された。そこで、本研究では、CRHの過剰産生が痙攣(神経細胞の異常興奮)を引き起こすか否かを分子生物学的に解明することを試みる。
研究成果:1.ラット胎仔の間脳部をパパイン/トリプシン酵素処理により細胞分散を行い、未分化神経細胞の初代培養系を樹立することを試みた。なお細胞をin vivoの状態に近づけるため、培養はラット平滑筋細胞(R22Cl-F)によって産性された生物学的細胞外基質(R22Cl-F matrix)上にて行った。SV40-T抗原温度感受性変異体(tsA58)とネオマイン耐性遺伝子とを同じベクター上に有する遺伝子発現ベクターをエレクトロポレーションてこの初代培養細胞中に導入し、ネオマイシン(0.8mg/ml)存在下、33℃で2週間培養した後、遺伝子導入細胞(コロニー)を抗-T抗体を用いた間接蛍光抗体法にて同定、クローニングすることを試みた。しかし、初代培養細胞は遺伝子導入に極めて脆弱であるため、不死化細胞を樹立することができなかった。2.このため、我々の樹立した未分化神経細胞株(HTLA230)へのCRHcDNA導入をおこなった。得られた各クローンについて、CRH高発現株をCRHcDNAをプローブとしたノーザンブロット、抗-CRH抗体による免疫組織化学法、ラジオイッムノアッセイ(RIA)にてスクリーニングしている。また、導入株が各種分化誘導因子に対して正常な応答性を示すか否かを検討する目的から、導入株をレチノイン酸処置した際の細胞の分化誘導を検討した。3.今後、この遺伝子導入細胞をラット脳内へ移植し、CRH過剰産生モデル動物がてんかんモデル動物となりうるか否かを検討する。