細胞壁形成がG2/M進行をコントロールする分子機構

• Project/Area Number: 09878158
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Cell biology
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 大矢 禎一 東京大学, 大学院・理学系研究科, 助教授 (20183767)
• Project Period (FY): 1997 – 1998
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1998)
• Budget Amount: ¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000); Fiscal Year 1998: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000); Fiscal Year 1997: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
• Keywords: 細胞壁 / 酵母 / 細胞周期チェックポイント

Research Abstract

出芽酵母の1,3-β-グルカン合成酵素の触媒サブユニットは、FKS1、FKS2と呼ばれる相同性の高い2つの遺伝子によってコードされており、両遺伝子の破壊は致死になる。そこで、FKS1 FKS2の二重破壊株にPCRによってランダムに変異の入ったfks1を持つプラスミドを導入し、37℃で増殖できない変異株をスクリーニングする方法で、17の温度感受性変異株を単離した。これらの株についてFKS1内のユニークな制限酵素サイトを用いてサブクローニングを行った結果、10個の変異株について温度感受性に関与している領域を限定し、変異部位を決定することが出来た。これら10個の変異株についてサブクローニングした変異を染色体内に組み込み、表現型が安定な状態で解析できるようにした。得られた10個の変異株が実際にグルカン合成に欠損を持つかどうか調べるために、それぞれの変異株から膜画分を調製し、in vitroのグルカン合成酵素活性を測定した。さらに、l,3-β-グルカンを特異的に染色するアニリンブルー色素を用いてin vivoでグルカンを作ることができるかどうか調べた。その結果、fks1-1114、fks1-1125、fks1-1144、fks1-1154の4つの変異株はin vitroのグルカン合成酵素活性が顕著に低下しており、制限温度下ではin vivoでもグルカン合成に欠損が見られた。グルカン合成と細胞周期進行との関連を調べるために、これらの変異株について制限温度下での細胞と核の形態を顕微鏡で観察し、DNA含量をFACS解析で調べた。その結果、 in vitro.in vivoでグルカン合成に欠損を持つ変異株は制限温度下で芽を持たないかあるいは小さな芽の様な突起を持った細胞を多数蓄積し、核は1核のままであったが、DNAの複製は正常に終了していた。この時、細胞の生存率は比較的高く保たれていたことから、細胞が単に死に絶えているわけではなく、グルカン合成に欠損が生じた際の細胞応答の1つの現れとしてG2/M期の細胞の蓄積が見られていると考えられた。この結果は、細胞のもっとも外側で起こっている細胞壁合成と細胞周期進行が密接に関わりを持ちながら制御されていることを示唆している。

Research Products

• [Publications] Homma,K.: "Phosphatidylinositol-4-Phosphate 5-Kinase Localized on the Plasma Membrane Is Essential for Yeast Cell Morphogenesis" J.Biol.Chem.273. 15779-15786 (1998)
• [Publications] Sekiya,-K.M.: "Identification of Functional Connections between Calmodulin and the Yeast Actin Cytoskeleton." Genetics. 150. 43-58 (1998)
• [Publications] Okano,H.: "Importance of Phenylalanine Residues of Yeast Calmodulin for Target Binding and Activation." J.Biol.Chem.273. 26375-26382 (1998)
• [Publications] Caplin B.E.: "Amino Acid Residues That Define Both the Isoprenoid and CAAX Preferences of the Saccharomyces cerevisiae Protein Farnesyltransferase." J.Biol.Chem.273. 9472-9479 (1998)
• [Publications] Helliwell,S.B.: "The THO1 effector PKC1,but not BNI1,mediates signalling from TOR2 to the actin cytoskeleton." Curr.Biol.22. 1211-1214 (1998)
• [Publications] Takita,Y.et al.: "Applications of the long and accurate polymerase chain reaction method in yeast molecular biology : Direct sequencing of the amplified DNA and its introduction into yeast." Yeast. 13. 763-768 (1997)
• [Publications] Sasamura,T.et al.: "Molecular cloning and characterization of Drosophila genes encoding small GRPases of the rab and rho families." Mol.Gen.Genet.254. 486-494 (1997)
• [Publications] Kawasaki,M.et al.: "Identification of three coke regions essential for protein splicing of the yeast Vma1 protozyme." J.Biol.Chem. 272. 15668-15674 (1997)
• [Publications] Nogami,S.et al.: "Probing structure and function of protein splicing element in the yeast VMA1 gene : intragenie suppression of Vma1 mutations." Genetics. 147. 73-85 (1997)
• [Publications] Kawasaki,M.et al.: "Protein splicing in the yeast Vmal protozyme : Evidence for an intramolecular reaction" FEBS Lett. 412. 518-520 (1997)
• [Publications] Kondoh,O.et al.: "Cloning of the RHOL geme from Candida albicans and its regulation of β-1,3-alucan synthesis" J.Bacteriol. 179. 7734-7741 (1997)