蛋白質活性に係わる分子間相互作用の固体NMRによる研究―βアミロイドを一例として

• Project/Area Number: 09J01128
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Bioproduction chemistry/Bioorganic chemistry
• Research Institution: Tohoku University (2011); Kyoto University (2009-2010)
• Principal Investigator: 増田 裕一 東北大学, 大学院・薬学研究科, 助教
• Project Period (FY): 2009 – 2011
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2011)
• Budget Amount: ¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000); Fiscal Year 2011: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2010: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2009: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: アミロイド / 固体NMR / メチオニン / 硫黄 / ラジカル / 凝集 / 神経細胞毒性 / 酸化ストレス / βアミロイド / クルクミン / オリゴマー / βシート / 立体構造解析 / アルツハイマー病 / β-シート

Research Abstract

アルツハイマー病因ペプチドである42残基のβアミロイド(Aβ42)は、Met-35の硫黄原子のラジカル化を介して神経細胞毒性を示す。そこで、Aβ42凝集体のMet-35の硫黄原子を固体NMRにより解析することにより、ラジカル化ならびに毒性発現メカニズムが明らかになると考えた。しかしながら、NMR信号が観測可能な^<33>Sは天然存在比が0.76%、感度が^<13>Cの10分の1なので、明瞭な固体NMRスペクトルを得ることは極めて困難である。本研究では、^<33>S標識したAβ42を化学合成し、超高感度高分解能固体NMRが可能なクライオMASプローブを用いて解析することを目的とした。
^<33>S標識L-メチオニンは市販されていないので、^<33>S単体を原料として合成した。まず、Boc-L-Asp-OtBuの側鎖カルボキシ基のボラン還元を行い、生じた水酸基をヨウ素化した。ヒドラジン存在下、硫黄単体と水酸化ナトリウムを反応させると安定な二硫化物イオンが得られるので、これと先のヨウ素化体のS_N2反応によりホモシスチンを得た。NaBH_4を用いてジスルフィド結合を開裂させた後、直ちにヨウ化メチルを加えてチオールのメチル化を行った。TFAによりBoc基とt-butyl ester基を脱保護することにより、^<33>S標識L-メチオニンを総収率22%で得ることに成功した。現在、本メチオニンを固相ペプチド合成に導入して、^<33>S標識Aβ42の合成を行っている。
一方、CaS(^<33>Sは天然存在比)をモデル化合物として用いたクライオMAS固体NMR測定では、室温コイルに比べて約3倍のS/N比を得ることに成功した。現在、合成した^<33>S標識L-メチオニンを用いて、^<33>Sシグナルの検出ならびに測定条件の最適化を行っている。

Research Products

• [Journal Article] Geranyl modification on the tryptophan residue of ComXRO-E-2 pheromone by a cell-free system (2012)
  • Author(s): Tsuji, F., Ishihara, A., Kurata, K., Nakagawa, A., Okada, M., Kitamura, S., Kanamaru, K., Masuda, Y., Murakami, K., Irie, K., Sakagami, Y.
  • Journal Title: FEBS Letters Volume: 586 Issue: 2 Pages: 174-179
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2011.12.012
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Solid-state NMR spectroscopic analysis of the Ca^<2+>-dependent mannose binding of pradimicin A (2011)
  • Author(s): Nakagawa, Y., Masuda, Y., Yamada, K., Doi, T., Takegoshi, K., Igarashi, Y., Ito, Y.
  • Journal Title: Angewandte Chemie International Edition Volume: 50 Issue: 27 Pages: 6084-6088
  • DOI: 10.1002/anie.201007775
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Solid-state NMR analysis of interaction sites of curcumin and 42-residue amyloid β-protein fibrils (2011)
  • Author(s): Masuda, Y., Fukuchi, M., Yatagawa, T., Tada, M., Takeda, K., Irie, K., Akagi, K., Monobe, Y., Imazawa, T., Takegoshi, K.
  • Journal Title: Bioorganic and Medicinal Chemistry Volume: 19 Issue: 20 Pages: 5967-5974
  • DOI: 10.1016/j.bmc.2011.08.052
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mapping of the primary mannose binding site of pradimicin A (2011)
  • Author(s): Nakagawa, Y., Doi, T., Masuda, Y., Takegoshi, K., Igarashi, Y., Ito, Y.
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society Volume: 133 Issue: 43 Pages: 17485-17493
  • DOI: 10.1021/ja207816h
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Sensitive ^<13>C-^<13>C correlation spectra of amyloid fibrils at very high spinning frequencies and magnetic fields (2011)
  • Author(s): Markus Weingarth
  • Journal Title: Journal of Biomolecular NMR Volume: In press
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The turn formation at positions 22 and 23 in the 42-mer amyloid βpeptide : the emerging role in the pathogenesis of Alzheimer's disease. (2010)
  • Author(s): Kazuma Murakami
  • Journal Title: Geriatrics & Gerontology International Volume: Suppl 1
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Monoclonal antibody against the turn of the 42-residue amyloid β-protein at positions 22 and 23 (2010)
  • Author(s): Kazuma Murakami
  • Journal Title: ACS Chemical Neuroscience Volume: 1 Pages: 747-756
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule (2010)
  • Author(s): Tatsuhiko Kondo
  • Journal Title: Plant and Cell Physiology 51 Pages: 1-8
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ポリフェノールによるアルツハイマー病予防の可能性 (2010)
  • Author(s): 増田裕一
  • Journal Title: FFIジャーナル 215 Pages: 53-59
  • NAID: 40017000571
  • Peer Reviewed
• [Presentation] アミロイドβ凝集体とクルクミンの相互作用部位の固体NMRによる解析 (2011)
  • Author(s): 増田裕一
  • Organizer: 第25回有機合成化学若手研究者の仙台セミナー
  • Place of Presentation: 東北大学薬学部(仙台)
  • Year and Date: 2011-12-03
• [Presentation] 固体NMRによるPradimicin Aのマンノース認識機構解析 (2011)
  • Author(s): 中川優
  • Organizer: 第53回天然有機化合物討論会
  • Place of Presentation: 大阪国際交流センター(大阪)
  • Year and Date: 2011-09-27
• [Presentation] Pradimicin Aによるマンノース認識機構の固体NMR解析 (2011)
  • Author(s): 中川優
  • Organizer: 日本農芸化学会2011年度大会
  • Place of Presentation: 京都女子大学(京都)
  • Year and Date: 2011-03-27
• [Presentation] アミロイドβオリゴマーの固体NMRによる立体構造解析 (2011)
  • Author(s): 増田裕一
  • Organizer: 日本農芸化学会2011年度大会
  • Place of Presentation: 京都女子大学(京都)
  • Year and Date: 2011-03-26
• [Presentation] Solid-state NMR analysis of the molecular interaction of Pradimicin A with Ca^<2+>ion and mannose (2011)
  • Author(s): Takashi Doi
  • Organizer: ISNMR(第50回NMR討論会記念国際シンポジウム)
  • Place of Presentation: Osanbashi Hall (Yokohama)
• [Presentation] Geranyl modification on the tryptophan residue of ComXRO-E-2 pheromone by cell free system (2010)
  • Author(s): Fumitada Tsuji
  • Organizer: The 2010 International Chemical Congress of Pacific Basin Societies (Pacifichem 2010)
  • Place of Presentation: Hawaii Convention Center (Honolulu, USA)
  • Year and Date: 2010-12-18
• [Presentation] Analysis of interaction sites of curcumin with the fibrils of 42-residue amyloid β-protein (Aβ42) using solid-state NMR. (2010)
  • Author(s): Yuichi Masuda
  • Organizer: The 2010 International Chemical Congress of Pacific Basin Societies (Pacifichem 2010)
  • Place of Presentation: Hawaii Convention Center (Honolulu, USA)
  • Year and Date: 2010-12-17
• [Presentation] Monoclonal antibody against the toxic turn structure of the 42-mer amyloid βpeptide (2010)
  • Author(s): Kazuma Murakami
  • Organizer: The 2010 International Chemical Congress of Pacific Basin Societies (Pacifiehem 2010)
  • Place of Presentation: Hawaii Convention Center (Honolulu, USA)
  • Year and Date: 2010-12-17
• [Presentation] アミロイドβプロトフィブリルの固体NMRによる立体構造解析 (2010)
  • Author(s): 土井崇嗣
  • Organizer: 第49回NMR討論会
  • Place of Presentation: タワーホール船堀(東京)
  • Year and Date: 2010-11-17
• [Presentation] 42残基のアミロイドβ(Aβ42)凝集体におけるクルクミンの相互作用部位の固体NMRによる解析 (2010)
  • Author(s): 増田裕一
  • Organizer: 第49回NMR討論会
  • Place of Presentation: タワーホール船堀(東京)
  • Year and Date: 2010-11-15
• [Presentation] Aβ42凝集体におけるクルクミン結合部位の固体NMRによる解析 (2010)
  • Author(s): 増田裕一
  • Organizer: 日本農芸化学会2010年度大会
  • Place of Presentation: 東京大学(東京都)
  • Year and Date: 2010-03-30
• [Presentation] 植物の気孔形成を誘導するペプチド性因子の構造と生理活性 (2010)
  • Author(s): 近藤竜彦
  • Organizer: 日本農芸化学会2010年度大会
  • Place of Presentation: 東京大学(東京都)
  • Year and Date: 2010-03-29
• [Presentation] アミロイドβの毒性コンホマーを標的とした立体構造特異的抗体 (2010)
  • Author(s): 村上一馬
  • Organizer: 日本農芸化学会2010年度大会
  • Place of Presentation: 東京大学(東京都)
  • Year and Date: 2010-03-29
• [Presentation] Analysis of Binding Sites of Curcumin in the Fibrils of 42-Residue Amyloid β-Protein (Aβ42) Using Solid-State NMR. (2010)
  • Author(s): Yuichi Masuda
  • Organizer: The 51st Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference (51st ENC)
  • Place of Presentation: Hilton Daytona Beach Ocean Walk Village hotel (Daytona Beach, USA)
• [Presentation] アミロイドβの毒性ターン構造特異的抗体 (2010)
  • Author(s): 村上一馬
  • Organizer: 第29回日本認知症学会学術集会
  • Place of Presentation: ウインクあいち(愛知)
• [Remarks]
  • URL: http://www.pharm.tohoku.ac.jp/~hannou/masuda/profile.html