老化関連遺伝子SIRT1による神経細胞死抑制メカニズムの解析

• Project/Area Number: 09J05137
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Neurochemistry/Neuropharmacology
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 藤田 幸 大阪大学, 医学系研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2009 – 2011
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2011)
• Budget Amount: ¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000); Fiscal Year 2011: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2010: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2009: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: SIRT1 / zyxin / 脱アセチル化 / Yeast Two-Hybrid法 / アポトーシス / NAD/NADH / 核内移行シグナル / 免疫沈降法 / NAD / NADH

Research Abstract

これまでに、SIRT1とzyxinがほ乳類細胞内で結合することを免疫沈降法により示したが、この実験系では、SIRT1,zyxin両者の結合が、直接結合であるか、細胞内因子などを介した間接的な結合によるのかについては定かではないnそこで、SIRT1とzyinが直接結合するか、in vitro pull-down assayにより検討した.大腸菌にGST-SIRT1またはHis-zyxin発現ベクターを導入し、Glutathione sepharoseまたはNi agaroseを用いてSIRT1、zyxinのタンパク質を精製することに成功した。また、zyxin deletion mutantとの結合を調べることにより、これまでに行った酵母での実験結果と同様に、zyxinのLIM domain3が、SIRT1との結合に必要であることを確認した。
さらに、申請者は、中枢神経系におけるSIRT1の機能を詳細に調べるため、脳組織におけるSIRT1の発現分布について検討した。Real-TimePCR法、Western blot法により、RNAレベル、タンパク質レベルでの両者の発現を解析した結果、SIRT1,zyxinともにマウスの各臓器で発現していることを確認した。マウスの発生段階ごとの両者の発現レベルを比較した結果、各発現段階で両者ともに発現していた。また、in vivoでのSIRT1の機能を調べるため、SIRT1の発現をRNAiで抑制し、アポトーシス細胞の増減をTUNEL染色で検討したCoSIRT1の発現抑制のため、pSuper-GFPvectorにSIRT1のsiRNA配列を導入し、SIRT1shRNAベクターを作成した。in ovo electropolation法によりニワトリ胚網膜細胞に導入し、SIRT1の発現を抑制することを試みた。

Research Products

• [Journal Article] RGMa modulates T cell responses and is involved in autoimmune encephalom (2011)
  • Author(s): Muramatsu, R., Kubo, T., Mori, M., Nakamura, Y., Fujita, Y., Akutsu, T., Okuno, T., Taniguchi, J., Kumanogoh, A., Yoshida, M., Mochizuki, H., Kuwabara, S., Yamashita, T.
  • Journal Title: Nature Medicine Volume: 17 Pages: 488-494
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Axotomy induces axonogenesis in hippocampal neurons through STAT3 (2011)
  • Author(s): Ohara, R., Fujita, Y., Hata, K., Nakagawa, M., Yamashita, T.
  • Journal Title: Cell Death Dis Volume: 2
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Zyxin is a novel interacting partner for SIRT1 (2009)
  • Author(s): Fujita, Y., Yamaguchi, A.Hata, K., Endo, M., Yamaguchi, N., Yamashita, T.
  • Journal Title: BMC Cell Biology 10:6
  • Peer Reviewed
• [Presentation] The mechanism of neogenin-induced apoptosis (2009)
  • Author(s): 藤田幸、山下俊英
  • Organizer: 第32回 日本神経科学大会
  • Place of Presentation: 愛知県 名古屋国際会議場
  • Year and Date: 2009-06-16
• [Presentation] The mechanism of neogenin-induced apoptosis (2009)
  • Author(s): 藤田幸、山下俊英
  • Organizer: 日本分子物学会 第9回 春季シンポジウム
  • Place of Presentation: 宮崎県シーガイアワールドコンベンションセンター
  • Year and Date: 2009-05-11
• [Remarks]
  • URL: http://www.med.osaka-u.ac.jp/pub/molneu/index.html
• [Remarks]
  • URL: http://www.med.osaka-u.ac.jp/pub/molneu/index.html
• [Remarks]
  • URL: http://www.med.osaka-u.ac.jp/pub/molneu/achievement.html