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生体分子を用いたIn vivo非侵襲的RNAリアルタイムイメージング法の開発

Research Project

Project/Area Number 09J05901
Research Category

Grant-in-Aid for JSPS Fellows

Allocation TypeSingle-year Grants
Section国内
Research Field Nanomaterials/Nanobioscience
Research InstitutionThe University of Tokyo (2011)
Tokyo Institute of Technology (2009-2010)

Principal Investigator

安藤 高史  東京大学, 大学院・薬学系研究科, 特別研究員(PD)

Project Period (FY) 2009 – 2011
Project Status Completed (Fiscal Year 2011)
Budget Amount *help
¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
Fiscal Year 2011: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Fiscal Year 2010: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Fiscal Year 2009: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
KeywordsRNA / Renilla Luciferase / BRET / complementation assay / real-time detection / EYFP / imaging / イメージング / 発光 / ルシフェラーゼ / Arginine rich motif peptide / 非侵襲イメージング / Luciferase / ARM peptide / complementation
Research Abstract

本研究では、生体内RNAの非侵襲的イメージングを目的として細胞内で産出可能なプローブを用いた新規RNA検出法の開発を行っている。今年度までに、本研究ではRenilla luciferaseのcomplementationを利用した発光プローブ(RLuc probe)及びRLucとEYFPを使用したBRET probeの開発に成功しin vitro及び生細胞中での詳細な特性解析を行った。in vitroの結果よりBRET probeはRLuc probeに比べRNAに対する結合力を損なっていた上、シグナル変化が比較的小さかったため、細胞内RNA検出の系にはRLuc probeを用いることとした。RLuc probeの細胞内での詳細な挙動解析を行うために試料としてRLuc probeを一過性発現させた細胞ライセートやTet-on system制御下のプローブを安定発現するHEK293細胞株を樹立した。その際、細胞内の幅広いターゲットRNAに対応させる事ができるか検証するため、局在化シグナル付加によりRLuc probeの局在変化も確認した。局在の確認は免疫染色法により確かめた。これらの結果、(1)RLuc probeは生細胞中でもRNAに対する特異性と親和性を損なわず特異的なRNA結合時に活性回復する (2)活性上昇率はin vitroの系より小さい (3)核内に局在する (4)MAPKK由来のNES配列付加により細胞質へ局在変化可能ことが分かった。特に(2)はin vitroとin vivoの環境の違いがタンパク質機能のアロステリック制御へもたらす影響の違いとして興味深い。(2)の理由として細胞内の高密度な環境に於いてはタンパク質のドメインの動きが制限されるため、活性変化率が小さいのではないかと考えられた。このRLuc probeと前年度までに開発した任意の配列検出のためのtransducerの役割を果たすspit-RNA probeを生細胞中で働かせることによって直接的に細胞に導入したRNAの発光シグナル変化による検出に成功した。これは生細胞中のRNAを直接的に生物発光で検出した初めての例となる。また今年度からは更なる高感度化のため量子収率及び発光波長の改善を目指し、有機合成的手法を取り入れRlucの基質であるセレンテラジンの類縁体合成を行い評価をしている。

Report

(3 results)
  • 2011 Annual Research Report
  • 2010 Annual Research Report
  • 2009 Annual Research Report
  • Research Products

    (5 results)

All 2011 2010 2009

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (3 results)

  • [Journal Article] Direct detection of RNAs in living cells using peptide-inserted Renilla luciferase2011

    • Author(s)
      Takashi Andou
    • Journal Title

      Analyst

      Volume: 136 Issue: 12 Pages: 2446-2449

    • DOI

      10.1039/c1an15130d

    • Related Report
      2011 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Development of an RNA detection system using bioluminescence resonance energy transfer2010

    • Author(s)
      Takashi Andou
    • Journal Title

      Sensors and Actuator B : Chemical

      Volume: (In press)

    • Related Report
      2010 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 生物発光プローブを利用した細胞内RNA検出法の開発2011

    • Author(s)
      安藤高史
    • Organizer
      電気化学会第78回大会
    • Place of Presentation
      横浜国立大学
    • Year and Date
      2011-03-29
    • Related Report
      2010 Annual Research Report
  • [Presentation] 生体分子プローブを利用したRNA検出法の開発2010

    • Author(s)
      安藤高史
    • Organizer
      第4回バイオ関連化学シンポジウム
    • Place of Presentation
      大阪大学豊中キャンパス
    • Year and Date
      2010-09-24
    • Related Report
      2010 Annual Research Report
  • [Presentation] BRETを利用したRNAイメージング法の開発2009

    • Author(s)
      安藤高史
    • Organizer
      第31回バイオマテリアル学会
    • Place of Presentation
      京都府民総合交流プラザ京都テルサ
    • Year and Date
      2009-11-17
    • Related Report
      2009 Annual Research Report

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Published: 2009-04-01   Modified: 2024-03-26  

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