| Project/Area Number |
10169255
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Chiba Institute of Technology |
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Principal Investigator |
高久 洋 千葉工業大学, 工学部, 教授 (50101267)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高井 和幸 千葉工業大学, 工学部, 講師 (40260848)
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| Project Period (FY) |
1998
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1998)
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| Budget Amount *help |
¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
Fiscal Year 1998: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
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| Keywords | 環状DNA / RNAキメラオリゴマー / アンチセンスDNA / センスRNA / RNase H活性 / レトロウイルス / 感染細胞 / 耐分解酵素性 |
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| Research Abstract |
現在、細胞質内で真のアンチセンス機能を発揮するアンチセンス核酸はまだ考案されていないそこで、本研究では全く新しい考え方のアンチセンスオリゴマー、すなわち、アンチセンスオリゴマーがウイルス感染細胞質または核内で、はじめてその機能を発揮できるような非常にユニークなオリゴマーを考案した。その構造はアンチセンスDNAとセンスRNAが二重鎖を形成し、両DNA-RNAをヘアピン型で結合した環状ダンベルRNA/DNAオリゴマーである。そこで、この環状ダンベルRNA/DNAオリゴマーの構築とその抗インフルエンザウイルス活性、さらにはその作用機序を明らかにすることを目的とする。
はじめに、RNA/DNA二重鎖の安定性を検討した。10mM NaClの存在下ではサークル型RNA/DNAキメラオリゴマー(CDRD)は81℃と天然型センスRNA/アンチDNA二重鎖より41℃高い融解点(Tm)を示した。また、興味あることとしてはまったくNaClのような塩が存在しなくてもCDRDは45℃と高いTm値を示したことである。このように、CDRDは通常のRNA/DNAやDNA/DNAよりも安定な二重鎖を形成する。
つぎに耐分解酵素性(3'-エキソヌクレース(snake venom phosphodiesterase)を調べた。3'-エキソヌクレースに対しては非修飾オリゴマーと比べた場合高い安定性を示した。しかし、ホスホロチオ工ートオリゴマーよりは低い値を示した。さらに、10%serum中での安定性を調べたところCDRDは天然型DNAオリゴマーより安定性であり、実際に細胞系に用いられる事が明らかとなった。最後に、実際にここで提案したダンベルRNA/DNAキメラオリゴマーの作用機序の解明を試みた。anti-ODNとanti-ODN(S)は4時間後にはほぼ完全に標的となるmRNAは切断された。また、ニックRNA/DNAキメラオリゴマー(NDRD)の場合もほとんど4時間でmRNAが切断された。一方、CDRDについては一旦センスRNAが切断された後に、さらにアンチDNAが標的となるmRNAに結合してから再びRNaseH活性を受けるため、anti-ODN、anti-ODN(S)、NDRDよりはややおくれてmRNAの分解が起こっている。以上の結果より、予想通りの反応機構で進行することを明らかにした。
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