気孔孔辺細胞における光情報伝達とH^+-ATPaseの活性制御

Research Project

Project/Area Number	10170224
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	島崎研一郎九州大学, 理学部, 教授 (00124347)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	木下俊則九州大学, 理学部・, 教務員 (50271101)
Project Period (FY)	1998
Project Status	Completed (Fiscal Year 1998)
Budget Amount *help	¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000) Fiscal Year 1998: ¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000)
Keywords	気孔 / 孔辺細胞 / 青色光 / 細胞膜H^+-ATPase / 蛋白質リン酸化 / 14・3・3蛋白質 / プロテインキナーゼ / Ca^<2+>
Research Abstract	本研究では、気孔孔辺細胞における青色光情報伝達とプロトンポンプ活性の制御機構を明らかにすることを目的として研究を行い、以下のような結果を得た。ソラマメ孔辺細胞プロトプラストに青色光を照射した後、ATP加水分解活性を測定すると、プロトン放出を良く説明できる活性の変動を見出した、このATP加水分解活性はvanadateに阻害され、細胞膜H^+-ATPaseの働きによるものであると推定された。そこで、孔辺細胞H^+-ATPaseの抗体を作成し、免疫沈降を行い、その沈降産物をSDS-PAGEで分離後、オートラジオグラフィーを行うとH^+-ATPase自身のリン酸化が見出された。このリン酸化は可逆的で、ポンプ活性の時間経過と良く一致した。また、プロテインキナーゼの阻害剤、K-252aを添加すると、このリン酸化は阻害され、ポンプ活性も阻害された。リン酸化部位はH^+-ATPaseのC-末の自己阻害領域を含む領域であること、リン酸化されるアミノ酸はスレオニンとセリンであることが示された。さらに、H^+-ATPaseの免疫沈降産物中に分子量32kDaの蛋白質が共沈し、この蛋白質は青色光照射により増加することが見出された。この蛋白質は抗体を用いた実験により、14-3-3蛋白質であると同定され、H^+-ATPase活性化に関与することが示唆された。一方、孔辺細胞の青色光情報伝達系に関与の予想される3つのプロテインキナーゼ(CDPK)とプロテインホスファターゼ(type1)の触媒サブユニットをクローニングし、その機能解析を行った。また、青色光によるプロトンポンプの活性化と気孔開口に、孔辺細胞内に存在する細胞内Ca^<2+>、おそらく、小胞体内のCa^<2+>が関与することを示唆する結果を得た。