ペルオキシソーム酵素の膜透過時の構造解析

• Project/Area Number: 10172208
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 小田 敏明 浜松医科大学, 医学部, 助教授 (90126805)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 内田 千晴 浜松医科大学, 医学部, 助手 (60223567) ; 三浦 恵 横浜市立大学, 医学部, 助教授 (60157427)
• Project Period (FY): 1998
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1998)
• Budget Amount: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 1998: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: セリンアミノ転移酵素 / ペルオキシソーム / 膜透過 / 尿酸酸化酵素

Research Abstract

ペルオキシソームマトリックス蛋白質がペルオキシソーム膜を通過するとき高次構造は保持されたままなのか、あるいは、変性状態になるのかを検討した。具体的には、ペルオキシソーム酵素の分子内部にロイシン10残基を挿入した変異体を作製し、その培養細胞内発現産物が電顕レベルでペルオキシソームマトリックスに検出されるのか、あるいはベルオキシソーム膜上に検出されるのかを調べた。ロイシン10残基は膜に強く結合すると考えられるので、変性状態を経て膜透過するのであれば、ペルオキシソーム膜面上に固定された染色パターンが見られるはずである。
1. 膜固定配列挿入変異体の作製
用いたペルオキシソームマトリックス酵素は尿酸酸化酵素、アシルCoA酸化酵素、3-ケトアシルCoAチオラーゼ、セリン:ピルビン酸アミノ転移酵素の4種である。それぞれの分子内部の3-4箇所にロイシン10残基をコードした塩基配列をフレームをあわせて挿入したクローンを作製した。発現ベクターは高発現が可能なpCAGGSを用いた。
2. COS-1細胞へのトランスフェクションと産物の局在
金コロイド法により細胞内局在を解析したところ、野性型酵素はいずれもペルオキシソームマトリックス、および細胞質に検出された。ところがロイシン挿入クローンではほとんどの産物がペルオキシソーム以外の細胞質膜系に局在した。ロイシン残基挿入により高次構造が変化し、ペルオキシソーム移行シグナルが抑制されたと考えられた。in vivoの系では分子内部に疎水瀬アミノ酸のクラスターを持つ蛋白質は通常のペルオキシソーム局在経路にのることができないと思われるので、in vitroのペルオキシソーム輸送系で解析することが必要であると結論された。