細胞増殖制御の新しいシグナル伝達径路に関わる蛋白質の立体構造の解明

• Project/Area Number: 10179205
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 田中 信夫 東京工業大学, 生命理工学部, 教授 (50032024)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮澤 恵二 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (40209896) ; 喜多村 直実 東京工業大学, 生命理工学部, 教授 (80107424)
• Project Period (FY): 1998
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1998)
• Budget Amount: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000); Fiscal Year 1998: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
• Keywords: 細胞増殖制御 / シグナル伝達 / 結晶構造

Research Abstract

HrsはHGF刺激された細胞において速やかにチロシンリン酸化される775アミノ酸残基からなるタンパク質で、初期エンドソームの細胞質側表面に存在し、細胞質および膜画分から検出される。また、ノーザンブロット解析により、多くの臓器や細胞で発現することが明らかになっている。その一次構造からZnフィンガーの存在が示唆されるが、本研究では、HrsのZnフィンガードメインのPtdIns(3)P認識機構の解明を目的に、Znフィンガードメインの発現系構築、精製、結晶化および機能解析を行った。
Hrs全領域をGST融合タンパクとして発現させたが、大腸菌内で分解され精製が不可能なため、また、アミノ酸残基290からはプロリン残基が富む領域であることからそのN末端側である1-289残基の領域(HrsN)をGSTとの融合タンパク質として大腸菌BL21(DE3)によって発現させ、大腸菌より溶出後、グルタチオンセファロース4Bゲルで粗精製した後にトロンビンによりGSTとHrsNを切り離した。その後、ゲルろ過力ラムSuperdex200による脱塩、グルタチオンセファロース4BゲルによるGSTの除去、MonoQによるイオン交換クロマトグラフィー、Superdex200による脱塩を経て最終試料とした。SDS-PAGEおよびNative-PAGEによる純度測定の結果、CBB染色で単一バンドとして検出された。
結晶化条件の初期検索はCrystaI ScreenIとIIを用いてハンギングドロップ蒸気拡散法でおこなった。その結果、HrsN濃度3mg/ml、温度20℃の条件でいくつかの条件で顆粒状の微小結晶が得られたが、その大きさが極めて小さいものであった。今後、結晶化実験を続ける予定である。