| Project/Area Number |
10179206
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Biological Sciences
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| Research Institution | Nagaoka University of Technology |
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Principal Investigator |
野中 孝昌 長岡技術科学大学, 工学部, 助教授 (30242457)
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| Project Period (FY) |
1998
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1998)
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| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 1998: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
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| Keywords | センチニクバエ / NF-kB / 転写因子 / X線結晶構造解析 |
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| Research Abstract |
先ず、タグとして6残基のヒスチジンをC末端に有する発現ベクターpET-23d(+)(Novagen社)に、59-kDa蛋白質のcDNAよりPCRにて調製した全長ORFを組み込み、リコンビナントベクタープラスミドを作製した。DNAシーケンサーでこの配列を確認した後、このプラスミドをホスト大腸菌BL21(DE3)にトランスフォーメーションした。遠心上清画分にリコンビナント59-kDa蛋白質が回収されていることを、抗59-kDa蛋白抗体を用いたイムノプロット法で確認した。更にHistidine Binding Resinを用いて精製したリコンビナント59-kDa蛋白質のDNA結合活性をゲルシフトアッセイにより確認した。次いで、培地としてSB培地とLB培地を、ホストとしてBL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、およびHMS174(DE3)pLysSを用い、培地とホストのすべての組み合わせについて実験を行った。その結果、SB培地における発現量がLB培地の場合よりも多かった。更に、精製条件の検討も含めて最適なホストの選択を行った。pLysSを持つ大腸菌の超音波破砕後の上清から得られた59-kDa蛋白質量は、BL21(DE3)の場合の約3倍であったが、pLysS由来のリゾチームを含む他の蛋白質の混入が認められ、純度はむしろ低下した。結局、BL21(DE3)から、最も純度の高い標品が得られるものと判断し、SB培地との組み合わせで、発現と精製を行うことにした。大量調製した精製59-kDa蛋白質の濃度は、ブラッドフォード法により13mg/mlと算定され、収量として培養1L当たり4.7mgの標品を得ることができた。
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