| Project/Area Number |
10671229
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Research Field |
Digestive surgery
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| Research Institution | Kawasaki Medical School |
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Principal Investigator |
川島 邦裕 川崎医大, 医学部, 講師 (20299233)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
清水 憲二 岡山大学, 医学部, 教授 (10037286)
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| Project Period (FY) |
1998 – 1999
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1999)
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| Budget Amount *help |
¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000)
Fiscal Year 1999: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000)
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| Keywords | 薬剤耐性 / 消化器癌 / mdr / mrp / Competitive PCR |
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| Research Abstract |
今年度は実験系を確立した。MDR、MRPの高発現株であるKB-C2よりRNAを抽出し、mdr-1、mrpの特定領域を増幅させるプライマーを使用してRT-PCR法を行い、増幅後、クローニングした。クローニングしたPCR productを制限酵素処理をしてinternal deletionを作ることによりcompetitorを作成した。mdrのPCRproductのサイズは609bpで、制限酵素NCoI+StuI処理をすることにより、120bp deletionの489bpのcompetitorを作成した。同様にmrpのPCR productは693bpで、BstP1+Stu 1処理をすることにより155bp deletionの538bpのcompetitorを作成した。このcompetitorはそれぞれ、先に使用したmdr、mrpと同じプライマーにて増幅することができ、しかもオリジナルの増幅産物とはproductの長さが異なるため、アガロース電気泳動での判別が可能であった。
competitorもクローニングし、濃度を測定し保存した。competitorを既知の濃度(1amol、2amol、5amol、10amol、100amol、1fmol、10fmol、50fmol、100fmol)で添加したPCR tubeに、KBC2より抽出したtotal RNA5μgより作成したcDNAを加えてcompetitive RT-PCRをすることで、KBC2のmdr、mrpを定量的に測定することができた。KBC2を使用した予備実験を行い、PCR条件、PCR回数を決定した。以上により腫瘍のmdr、mrpを定量的に測定するcompetitive PCR法が確立された。
現在、川崎医科大学にて手術を施行され、腫瘍が凍結保存されている各種消化器癌症例を対象に、今年度購入した多検体を一度に処理できるオイルフリーPCR装置を使用し、上記により確立された方法でcompetitive PCRを施行し、薬剤耐性遺伝子発現の定量を行っている。
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