Kex2様プロテアーゼ前駆体の細胞内活性化メカニズムの解明

• Project/Area Number: 10760046
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 応用微生物学・応用生物化学
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 中川 寅 岐阜大学, 農学部, 助手 (10281049)
• Project Period (FY): 1998 – 1999
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1999)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 1999: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 1998: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
• Keywords: furin / Kex2 / 前駆体 / 細胞内局在 / 蛍光抗体法 / プロペプチド / Furin / 活性化 / チオレドキシン / 封入体

Research Abstract

【目的】FurinはKex2 プロテアーゼファミリーに属する細胞内セリンプロテアーゼで、前駆体蛋白質のArg-Xaa-Lys/Arg-Arg↓部位での限定切断を触媒する。Furin自身も前駆体として合成され、自己触媒的に活性化することが知られているが、その詳細は不明である。本研究では、furin前駆体の細胞内活性化メカニズムを明らかにすることを目的とした。
【方法】野生型ヒトfurinおよびHomeB領域に変異をもつLoVo furin(429FSとW547R)cDNAを操作して、プロペプチドのN末端にHAタグ、C末端にFLAGタグを付加した。これらのfurinをCOS-7細胞で発現させ、細胞内局在とプロペプチドの切断の有無を蛍光抗体法により解析した。タグの検出には市販の抗HA抗体および2種類の抗FLAG抗体(M1とM2)を使用した。M1抗体は遊離のアミノ基をもつFLAGタグのみを認識するために、プロペプチドが切断されたfurin分子のみと反応し、プロペプチドをもつfurin前駆体とは反応しない。
【結果・結論】野生型furinはM1抗体とM2抗体でゴルジパターンが得られ、HA抗体では検出されなかった。この結果はプロペプチドが切断された成熟型furinの局在と矛盾しない。LoVo変異型furinはどちらもHA抗体とM2抗体で小胞体パターンが得られ、M1抗体では検出されなかった。この結果はこれまでの報告を支持するとともに、プロペプチドの切断が起きていないことを示している。これらの結果から、furinのHomoB 領域の変異は小胞体におけるfurin前駆体のプロペプチドの切断を妨げることが明らかになり、ファミリー間で高度に保存されているこの領域が、プロペプチドの切断において重要な役割を担っていることが示唆された。