ピロロキノリンキノンの生合成過程の解明

• Project/Area Number: 10760054
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 応用微生物学・応用生物化学
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 外山 博英 山口大学, 農学部, 助手 (60240884)
• Project Period (FY): 1998 – 1999
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1999)
• Budget Amount: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 1999: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 1998: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
• Keywords: PQQ / ピロロキノリンキノン

Research Abstract

ピロロキノリンキノン(PQQ)は、NAD(P)やフラビン類を利用しない脱水素酵素の補酵素である。チロシンとグルタミン酸が前駆体とされたが、それらがどのような反応過程を経てPQQへと変換されるのかは現在でも明らかにされていない。M.extorquens AM1において、生合成に関与する事が同定されている6つないし7つの構造遺伝子のうちの一つ(pqqC)の変異株が前駆体を蓄積するので、その構造解析を行った。MALDI-TOFMSによる解析では推定構造と矛盾しない結果が得られた。推定構造のトリメチルエステル体の化学合成を依頼し、入手した。常法に従ってアルカリ条件下ではメチルエステルをはずしたところ、推定構造の化合物は得られず、PQQが生じた。この生成量は嫌気条件下で減少した。pqqC変異株から精製した前駆体もアルカリ条件下でPQQに変換されるので、推定構造が正しい事が示唆された。PqqC/Dタンパク質の酵素活性について検討した。酵素反応にはPqqC部分のみで十分であり、また、前駆体を生産する変異株はPqqC部分に変異があることが示された。PqqC/D酵素反応を様々な還元剤存在下で行ったところ、PQQ生産量は減少した。分子状酸素の関与が示唆されたので同位体ラベル実験を行った。これらの結果は日本農芸化学会大会(平成12年4月)に発表する。また、生合成に関与する遺伝子群の下流に存在するジオキシゲナーゼ様の酵素について、その遺伝子配列を決定し、大腸菌内で融合タンパク質として大量に発現させた。また、M.extorquens AM1の遺伝子破壊株を作成し、生合成に関与していないことを示した。これらの成果は日本農芸化学会大会(平成11年4月)にて発表した。この研究過程で、PQQが鉄イオンにより化学的に分解を受けることが示された。