大腸癌モデルマウスを用いた遺伝子治療の基礎実験

• Project/Area Number: 10770636
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Digestive surgery
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 菅野 雄介 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (60287224)
• Project Period (FY): 1998 – 1999
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1999)
• Budget Amount: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000); Fiscal Year 1999: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 1998: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: 大腸癌モデルマウス / 遺伝子治療 / Min mouse / APC遺伝子 / 大腸腺腫 / Adeno Virus / 肝細胞成長促成因子HCG / Cre / loxP system / 切除後肝再生補助

Research Abstract

APC遺伝子のexon 1から14までの約2キロベースをmRNAからRT PCRで増幅する。正常マウスの腸管からIso-gen kitを用いてmRNAを抽出し、逆転写酵素でcDNAを作製する。exon 1から14に特異的な塩基配列にSubcloningしやすい様に制限酵素のsiteを付加したPCRプライマーを作成し、GeneAmp Kitを用いてPCRを行ない正常マウスAPC遺伝子exon 1〜14を増幅する。pCMV-Flag Plasmid にレポーター遺伝子Flag 蛋白とAPC遺伝子が接合するようにSubcloningする。同時にexon 15に特異的なPCRプライマーを作成し、exon 15を増幅し、上記のPlasmidに結合し、APC遺伝子8535ベース全長を構築する。Adeno Virus Expression kitを用いて、Flag-APC遺伝子をコスミドベクターに導入する。Cre遺伝子を組み込んだコスミドベクターと制限酵素処理済みDNA-TPCとを293細胞にco-transfectにより導入し、相同組換えを起こし非増殖型の組換えアデノウイルスを得る。現在、再考を加えつつ導入遺伝子を作製中である。