アルカリフォスファテース遺伝子導入による培養歯髄細胞の硬組織形成能

• Project/Area Number: 10771050
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Conservative dentistry
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 大原 直子 長崎大学, 歯学部, 助手 (80301365)
• Project Period (FY): 1998 – 1999
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1999)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 1999: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000); Fiscal Year 1998: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: 歯髄細胞 / アルカリフォスファテース / GFP / 遺伝子組換え / 石灰化 / アルカリファスファテース

Research Abstract

1、アルカリフォスファテース発現量と硬組織形成能に関する検討
抜去したヒト健全歯の歯髄組織から遊走した歯髄細胞を継代培養した。アルカリフォスファテース活性を測定したところ、検出限界程度の低活性値を示した。そこで、アルカリフォスファテース高発現性のヒト骨肉腫細胞株(NOS-1)を入手し、硬組織形成能の比較検討を行なった。培地にグリセロリン酸カルシウムを添加し硬組織形成誘導を行なったところ、NOS-1のみに細胞の層状化がみられ石灰化組織を観察できた。アルカリフォスファテースの発現量は硬組織形成能に大きく影響することが明らかとなった。
2、アルカリフォスファテース遺伝子のクローニングとベクター作製
NOS-1細胞を破砕後、オリゴdTカラムによりmRNAを抽出した。また、データベース登録配列をもとに臓器非特異型のアルカリフォスファテースに対するPCRプライマーを設計しRT-PCRを行ない、アルカリフォスファテース遺伝子のクローニングに成功した。またこの遺伝子断片を発現ベクター(pEGFP-N1)に挿入し、グリーンフルオレッセントプロテイン(GFP)とアルカリフォスファテースの融合融蛋白質をを発現可能なベクターを作製した。
3、培養歯髄細胞の形質転換
遺伝子の導入効率がよく、in vivoへも応用可能なエレクトロポーレーション法の可能性を検討した。歯髄細胞を培養皿でほぼコンフルエントになるまで培養し、皿電極にてエレクトロポーレーションを行った。GFPの発現にて遺伝子の導入を確認し、ネオマイシン耐性の形質転換細胞を選択した。現在、形質転換細胞の硬組織形成能については確認中である。
本研究から、細胞移植という、直接覆髄、生活断髄後の修復被蓋象牙質形成に関して新しい概念にもとづく治療法に発展させることの可能性が示唆された。