| Project/Area Number |
10771311
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Biological pharmacy
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
花田 賢太郎 国立感染症研究所, 細胞化学部, 室長 (30192701)
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| Project Period (FY) |
1998 – 1999
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1999)
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| Budget Amount *help |
¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Fiscal Year 1999: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 1998: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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| Keywords | スフィンゴ脂質 / スフィンゴシン / セリンパルミトイル転移酵素 / ペプチド親和性クロマトグラフィー / 膜タンパク質 / スフィンゴミエリン / 突然変異細胞 / CHO細胞 |
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| Research Abstract |
スフィンゴ脂質生合成の初発ステップを担う酵素・セリン-パルミトイル転移酵素(SPT)は、少なくとも二種類のサブユニット(LCB1,LCB2)から構成される膜蛋白質である。SPTの精製が未だ成功しておらず、この酵素のサブユニット組成および触媒反応の詳細は解明されていない。そこで、この膜結合型複合酵素を極めて効率よく精製する方法を遺伝子工学的手法を取り入れて開発した。すなわち、先ず、FLAGペプチドおよびHis_6配列を付加したLCB1蛋白質を発現するベクターを構築し、内在性LCB1蛋白質が欠損したCHO細胞変異株(LY-B株)に遺伝子導入した。そして、得られた細胞株の膜画分から可溶化し、FLAG抗体クロマトグラフィーおよびNi-NTAクロマトグラフィーに供して、SPTを均一にまで精製した。精製SPTを解析した結果、本酵素はLCB1蛋白質とLCB2蛋白質が一対一の比で会合している複合酵素であることが明らかにした。さらに、生体中のスフィンゴシシの鎖長が主に18であることの原因は、SPTのアシルCoA選択性に起因することを示した。また、アミノ酸基質L一セリンのアミノ基、カルボキシル基、水酸基の全てが、SPTの基質認識に必須であることを明らかにした。しかし、興味深いことに、D一セリンは酵素基質とはならないが、SPT反応を競合的に阻害することを発見した。
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