| Project/Area Number |
10780367
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Structural biochemistry
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
加畑 博幸 京都大学, 大学院・工学研究科, 助手 (70293884)
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| Project Period (FY) |
1998 – 1999
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1999)
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| Budget Amount *help |
¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Fiscal Year 1999: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 1998: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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| Keywords | T7RNAポリメラーゼ / 転写 / 伸長固定化 / DNA / リプレッサー / 蛍光 / 1分子ダイナミクス / RNAポリメラーゼ / 伸長固定化DNA / スライディング |
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| Research Abstract |
T7RNAポリメラーゼがDNA鎖に沿ってRNA鎖を合成するときの転写運動を同定するため、T7RNAポリメラーゼ分子を蛍光顕微鏡下で可視化した。可視化には、ポリメラーゼ1分子に100分子の蛍光色素が導入される必要がある。そこで、ストレプトアビジン蛋白質を蛍光色素TRITCで修飾して蛍光タグとし、これをあらかじめポリメラーゼに導入したビオチン残基と結合させることでポリメラーゼ分子を蛍光修飾する方法を開発した。この蛍光タグは、硫安分画法を用いることで未修飾のTRITC分子や可視化に不充分な数のTRITCで修飾されたアビジンとは別の画分に精製され、タグ1分子にTRITCが100分子以上結合していることを分光法により確認した。この蛍光タグを修飾したT7RNAポリメラーゼの溶液をスライドグラスに滴下して観察したところ、溶液中で明るい光点として検出された。
ポリメラーゼの運動がDNA上で生じていること証明するためには、DNAを蛍光色素Yo-Proにより可視化しなければならない。そこで、Yo-Proがポリメラーゼの転写活性に与える影響を調べるため、Yo-Pro存在下および非存在下でのRNA合成産物の量をオートラジオグラフィーにより比較した。大過剰のYo-Pro存在下では非存在下にくらべ転写産物の量が二分の一に減少したが、DNAの検出に十分な濃度のYo-Pro存在下では転写産物の量に変化は見られなかった。このことから、ポリメラーゼとDNAの2重染色を行なった状態での転写運動の顕微鏡観察が可能であることを見出した。現在までに、転写運動の初期段階であるバイナリーコンプレックスの形成の可視化に成功している。
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