サイクリン分解関連酵素Cdc53(Cul-1)の単離とノックアウトマウスの作製

• Project/Area Number: 10780445
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Cell biology
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 中山 啓子 九州大学, 生体防御医学研究所, 助教授 (60294972)
• Project Period (FY): 1998 – 1999
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1999)
• Budget Amount: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000); Fiscal Year 1999: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 1998: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: サイクリン / マウスCul1 / ユビキチンリガーゼ / SCF複合体 / 蛋白分解 / Cdc53 / マウスCu1-1

Research Abstract

酵母ですでに知られている、ユビキチンリガーゼのマウス相同遺伝子を単離し、その生物学的機能を知るためにノックアウトマウスを作製した。
1.酵母SCF複合体のマウス相同遺伝子を、ESTdatabase上で検索し、マウスCul1のcDNA塩基配 列の一部を得ることができた。
2.上記のcDNAの一部をプローブとして、マウス胸腺cDNAライブラリーをスクリーニングし、マウスCul1のcDNA上タンパクコード領域全長を得ることができた。
3.cDNA全長をプローブとし、129マウスゲノムライブラリーをスクリーニングし、9個の独立したクローンを得た。
4.上記クローンを解析することによって、マウスCul1遺伝子は少なくとも、60kbpに及ぶ大きな遺伝子であることが分かった。
5.翻訳開始コドンをコードするエクソンを含む遺伝子領域、約1kbpをネオマイシン耐性遺伝子で置換したターゲティングベタターを構築し、ES細胞にトランスフェクションし、相同組み換え体を得た。
6.相同組み換えES細胞をブラストシストにインジェクションして、キメラマウスを得、さらに交配を繰り返し、cul1ヘテロノックアウトマウスを得ることができた。
7.ヘテロノックアウトマウス同士を交配したが、ホモノックアウトマウスは産まれず、胎生致死であることが判明した。
8.Cul1ノックアウトマウスはいずれも胎生6.5〜7.5日目に死亡し、サイクリンEおよびβ-カテニンの蓄積が見られたので、致死の原因はSCF複合体によって蛋白分解を受けるべき様々な蛋白の以上蓄積に寄るものであると考えられた。

Research Products

• [Publications] Shirane,M.: "Common pathway for the ubiquitination of IκBα,IκBβ,and IκBε mediated by the F-box protein FWD1"J.Biol.Chem.. 274. 28169-28174 (1999)
• [Publications] Kitagawa,M.: "An F-box protein,FWD1,mediates ubiquitin-dependent proteolysis of β-catenin."EMBO J.. 8. 2401-2410 (1999)
• [Publications] Hatakeyama,S.: "Ubiquitin-dependent degradation of IκBα is mediated by a ubiquitin ligase Skp1/Cul1/F-box protein FWD1"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 96. 3859-3863 (1999)
• [Publications] S.Hatakeyama: "Ubiquitin-dependent degradation of IκBα mediated by a ubiquitin ligase Skpl/Cullin/F-box protein FWD1" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. (in press).