アルタナティブスプライシングを調整する遺伝子の新規 クローニング法の開発

• Project/Area Number: 10876018
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 応用微生物学・応用生物化学
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 鈴木 徹 岐阜大学, 農学部, 助教授 (20235972)
• Project Period (FY): 1998 – 1999
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1999)
• Budget Amount: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000); Fiscal Year 1999: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000)
• Keywords: アルタナティブスプライシング / FGFR2 / GFP / 遺伝子クローニング / ミニジーン / 前立腺ガン / 前立腺がん

Research Abstract

アルタナティブスプライシングよって、エキソンのスイッチングが起ることを、容易に検出することが出来る系を構築した。線維芽細胞増殖因子(FGF)ファミリーのリセプターの一つであるFGFR2は、細胞外に、免疫グロブリン様のループ構造を2つないし3つ有する。このうち最後のループに対応するエキソンが2つ存在し、IIIb,IIIcと呼ばれる。これらのエキソンは、細胞の分化あるいはがん化の過程でスイッチングされる。すなわち、上皮系の細胞においては、IIIbタイプのスプライシングが起き、その他の細胞では、IIIcエキソンが選択される。この制御に関わる遺伝子は、これまでに発見されていない。
今回の研究では、このIIIb IIIcを含む領域をプラスミド上にクローン化したミニジーンの下流にGFPをクローン化した。また、IIIb、IIIcそれぞれに、ストップコドンを導入した変異体を構築した。これを、動物細胞に導入し、スプライシングが起きるか否かを、GFPの蛍光の発光で検出することを確認した。これらの、ミニジーンを有するプラスミドを、FGFR2IIIbを発現している比較的良性の前立腺癌細胞DT-3、および、悪性かした前立腺癌細胞AT-3に導入し、抗生物質ジェネティシンで選択することにより、パーマネントトランスフェクタントを得た。IIIbに変異を有するミニジーンは、DT-3では、蛍光を発せず、AT-3で蛍光をを発した。また、IIIcに変異を有するミニジーンは、AT-3では、蛍光を発せず、DT-3で蛍光をを発した。これらのレポーター細胞を用いることに、スプライシングの調整因子のクローニングが可能になると考えられた。