非ペプチド性運動神経栄養因子の精製と構造解析

• Project/Area Number: 10876025
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Bioproduction chemistry/Bioorganic chemistry
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 片岡 宏誌 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (60202008)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 程 久美子 日本医科大学, 医学部, 講師 (50213327)
• Project Period (FY): 1998
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1998)
• Budget Amount: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000); Fiscal Year 1998: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
• Keywords: 運動神経 / 神経栄養因子 / RNA / 構造解析

Research Abstract

ニワトリ18-19日胚の骨格筋1kgから食塩水抽出、沈澱法、カラムクロマトグラフイー、HPLCによる精製により、脊髄神経細胞に対して生存維持活性を示す物質の精製を行った。その結果、最終段階の逆相HPLCでブロードではあるが、単一なピークとして活性物質を得た。最終精製物は258nmに最大吸収をもつことから予想通り、非ペプチド性物質であると考えられた。プロトンNMRではいずれのシグナルもブロードであったことから、活性物質はポリマー分子であることが予想された。また、リボース、プリン環およびピリミジン環に由来するプロトンシグナルが観測されたことからRNAである可能性が示唆された。そこで、粗抽出物について核酸抽出の常法であるフェノール・クロロホルム抽出、さらにエタノール沈澱を行い、試料中の活性を調べたところ、活性は完全に維持されていた。また、このエタノール沈殿物および最終精製物についてRNase、DNase、Proteinaseによる失活実験を行ったところ、DNaseおよびProteinase処理では活性は維持されたが、RNaseによってほぼ完全に活性が失われた。以上の結果からニワトリ胚骨格筋に含まれる脊髄神経細胞に対して生存活性を示す物質はRNAであると結論した。次に最終精製物であるRNAの配列を明らかにするため化学修飾分解法および塩基特異的切断酵素を用いた酵素分解法を併用して配列分析を行った。しかし、最終精製物の純度が低いために確実な配列を明らかにすることができなかった。現在、最終精製物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製し、配列分析を行っている。