移植心筋へのイオンチャネル遺伝子導入による心臓電気興奮性の制御

• Project/Area Number: 10877207
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Thoracic surgery
• Research Institution: 大分医科大学
• Principal Investigator: 穴井 博文 大分医科大学, 医学部, 助手 (20291544)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 葉玉 哲生 大分医科大学, 医学部, 教授 (00145377) ; 平岡 善憲 大分医科大学, 医学部, 助手 (90253799) ; 小野 克重 大分医科大学, 医学部, 教授 (40253778)
• Project Period (FY): 1998 – 1999
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1999)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 1999: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 1998: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
• Keywords: イオンチャンネル / アデノウィルス / 心移植 / lacZ / 電気生理学 / イオンチャネル

Research Abstract

イオンチャネルの遺伝子(cDNA)を移植心筋細胞に導入して電気的に機能するイオンチャネルを発現させることを目的として以下の手順で実験を行った。ラット異所心移植モデルを作製した後、心筋に本来存在しないイオンチャネルのcDNAをアデノウィルスを用いる方法で心筋細胞内に導入してイオンチャネルを発現させることで移植心筋の電気興奮性の変化を調節する。心移植モデルを作製して、拒絶をおこした心筋にイオンチャネルのcDNAを導入して拒絶心筋の興奮性を変化させる。結果として、(1)組み替えアデノウィルスの作成;過性外向き電流関連カリウムチャネルをコードする遺伝子(Kv4.1及びKv4.2)を含むアデノウィルスの懸濁液を作成、。(1)入手したウィルス液は力価が不十分なため、293細胞に感染させ、力価を10^9TCID50/mlまで上昇させた。(2)Kv4.1及び、Kv4.2をECORIで切り出せるようなプラスミドを作成した。(3)発現ユニットをクローニングサイトに挿入するためコスミドカセットを用いてKv4.1を相同組み替えのため293細胞へ導入した。(4)ウィルス液を遠心して表眉を取りウィルスバンドを取り出した。(5)組み替えウィルスの作成が完成したらバファーとCsC1よる超遠心を繰り返して精製しMOI500程度の感染粒子を得た。(2)組み替えウィルスの移植心筋細細胞内導入(In Vivo):Kvチャネルの遺伝子を自己DNAの一部に取り込んだ組み替えウィルスのcDNAを、Ono-Linseyモデルで作成した、ラット腹腔内同種異所に移植した心筋層に導入をはかる。移植心筋内への導入遺伝子は電気生理学的に確認するには極めて小量であり、高電圧パルスによる方法等によって導入効率を改善することが必要とされる。この方法によりlacZ染色された細胞の割合は20倍程度増加し、標的組織の30%程度までイオンチャネルが発現していることが推測される。今後は発現効率を更に上げ、イオン電流として心電図の変化として捉えられる程度までの導入成績を目指したい。

Research Products

• [Publications] K.Ono et al.: "Mechanism of preservation of myocardial calcium channel function by pyruvate cardioplegic solution."J Lab Clin Med. 131. 136-145 (1998)
• [Publications] N.Gondo et al.: "Four conductance levels of cloned cardiac L-type Ca^<2+> channel α1 and α_1/β subunits."FEBS Letters. 423. 86-92 (1998)
• [Publications] T.Wada et al.: "Detection of acute cardiac rejection by analysis of heart ratevariability in heterotopically transplanted rats."J Heart Lung Transpl. 18. 499-509 (1999)
• [Publications] K.Ono et al.: "Mechanism of fluoride action on the L-type calcium channel in cardiac ventricular myocytes."Cell Calcium. 26. 37-47 (1999)
• [Publications] K.Ono et al.: "Selective block of late currents in the ΔKPQ-Na channel mutant by pilsicainide and lidocaine with distinct mechanisms."Mol Pharm. 57. 392-400 (1999)
• [Publications] K.Ono et al.: "Mechanissm of preservation of myocardial calcium channel function by pyruvate cardioplegic solution." J Lab Clin Med. 131. 136-145 (1998)
• [Publications] N.Gondo et al.: "Four conductance levels of cloned cardiac L-type Ca'^<2+> channel α_1 and α_1/β subunits." FEBS Letters. 423. 86-92 (1998)