関節疾患に対する遺伝子治療における新しいベクターの開発

Research Project

Project/Area Number	10877229
Research Category	Grant-in-Aid for Exploratory Research
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Orthopaedic surgery
Research Institution	Kyoto Prefectural University of Medicine
Principal Investigator	久保俊一京都府立医科大学, 医学部, 助教授 (20178031)
Project Period (FY)	1998 – 1999
Project Status	Completed (Fiscal Year 1999)
Budget Amount *help	¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000) Fiscal Year 1999: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000) Fiscal Year 1998: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Keywords	関節軟骨 / AAVベクター / GFP / 軟骨基質 / 遺伝子治療 / 関節疾患 / アデノウイルス随伴ベクター / 軟骨細胞
Research Abstract	われわれはすでにin vitroにおいて培養軟骨細胞に対し、非増殖型アデノウイルスベクターを用いて外来遺伝子導入を行い、導入遺伝子が高率にかつ長期間発現することを確認し、アデノウイルスベクター法が高度に分化した非増殖型細胞に対しても有効であることを証明した。また直接関節内にアデノウイルスベクターを投与した場合滑膜細胞へは高率に遺伝子導入が可能であったが、軟骨細胞へは十分な遺伝子導入高率が得られなかった。その要因として軟骨周囲の豊富な基質が通過障害因子となっていることが考えられる。そこでアデノウイルスベクターの大きさ80nmに対しさらに小さいベクターの開発が必要である。そこで直径が20nmのアデノウイルス関連ベクター(AAV)を用いて、関節に対する応用の可能性を検討した。骨腫瘍患者の手術時または人工関節置換術時に得られたヒト関節軟骨から軟骨細胞を単離し、平板培養を行った。サイトメガロウイルスプロモーターからGreen Fluorescent Protein(GFP)を発現するAAVベクターを構築し、軟骨細胞に対し遺伝子導入を行った。導入遺伝子後、軟骨細胞に489nmの励起光を照射し、緑色光の発光を蛍光顕微鏡をもちいて確認し、発現している軟骨細胞の割合について検討を行った。初代培養軟骨細胞に対する遺伝子導入効率は、遺伝子導入1日後では16%であったが、遺伝子導入7日後には95%に増加した。基質に囲まれた軟骨細胞に対しては深層の細胞まで十分に遺伝子導入でき、遺伝子導入効率は54%であった。さらに導入した遺伝子の発現は28日間持続した。これらの結果からAAVベクターは、軟骨細胞に対する遺伝子導入法として優れたベクターであることが明らかになった。また関節内に直接AAVベクターを投与するin vivo遺伝子導入法に応用することで、深層に至るまで軟骨細胞に遺伝子発現が得られる可能性が高い。