キメラ受容体を用いたアドレナリン受容体とオピエートμ受容体の相同性の検索

• Project/Area Number: 10877243
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Anesthesiology/Resuscitation studies
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 溝部 俊樹 京都府立医科大学, 医学部, 講師 (50239266)
• Project Period (FY): 1998
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1998)
• Budget Amount: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 1998: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
• Keywords: キメラ受容体 / アドレナリン受容体 / オピエート受容体 / 相同性

Research Abstract

1) chimeric receptorの作成
pGEM3Z vector上のヒトβ2アドレナリン受容体のTMD#4をrestriction enzymeを用いて切り出した。オピオイドμ受容体のTMD#4の塩基配列とrestriction siteを持つoligodeoxynucleotide(ODN)を作成しannealし、TMD#4を切り出したヒトアドレナリン受容体とこのODNをT4 ligaseを用いてligationした。これをmaxiprepし、Sanger法によるsequence analysisによって目的のキメラ受容体が得られているのを確認した後、このキメラ受容体をpCDNA3 vectorに移した。
2) chimeric receptorのtransient transfection(DEAE dextran法)
70%confluentとなったCOS7 cellをconstructを挿入されたpCDNA3 vector、及びDEAE dextranを含んだPBSとともにincubateした。48から72時間後にcell membraneをharvestした。
3) chimeric receptorの機能解析(radiolabelled ligand binding assay)
hot ligandとしてadrenergic ligandである3H-DHAを用いたbinding isothermを行いKd valueを求めようとしたが、このキメラ受容体は、3H-DHAに対して、親和性を認めなかった。すなわちこのキメラ受容体は、non-functionalであった。
以上より、アドレナリン受容体とオピエートμ受容体の相同性は、TDM#4に関してはないと考えられる。