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蛍光を用いたPKCリガンドの2段階結合評価系の構築とバイオセンサーへの応用

Research Project

Project/Area Number 10J02617
Research Category

Grant-in-Aid for JSPS Fellows

Allocation TypeSingle-year Grants
Section国内
Research Field Drug development chemistry
Research InstitutionTokyo Medical and Dental University

Principal Investigator

大橋 南美  東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 特別研究員(PD)

Project Period (FY) 2010 – 2011
Project Status Completed (Fiscal Year 2011)
Budget Amount *help
¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
Fiscal Year 2011: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Fiscal Year 2010: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
KeywordsPKC / ペプチド / バイオセンサー / 環境応答性蛍光基 / リガンドスクリーニング / ハイスループットスクリーニング / 蛍光性δClb / 蛍光標識 / 蛍光性δC1bドメイン
Research Abstract

蛍光を用いたPKCリガンドの2段階階評価系の構築とバイオセンサーへの応用を目的とし、蛍光標識したPKCリガンド結合ドメイン(C1b)を用いる評価系のリガンド結合検出感度の向上を試みた。蛍光性δC1bを基にした評価系では、リガンド結合に伴う環境応答性蛍光基近傍の環境変化に起因する蛍光強度の増大によりリガンドの結合を検出する。なので、リガンド結合ポケットと蛍光基の距離が検出感度に影響すると考えた。そこで、リガンド結合ポケットと蛍光基の距離の最適化を行うためのリンカー長を変えた新たな蛍光性δC1bの作製に用いる蛍光修飾されたアミノ酸誘導体の合成に着手した。これまで作成した蛍光性δC1bのリンカー長(1nm)を参考に、αCから0.3nm-1.5nm離れた側鎖部分に蛍光基を有する蛍光性Fmocアミノ酸を合成した。既存の蛍光性δC1bよりも短い0.6nmのリンカーを有する蛍光性δC1bを作成し、[^3H]PDBuを用いた競合阻害実験行ったところwild typeと同等の[^3H]PDBu結合活性を示した。また、競合阻害実験において実際にリガンドと結合している分子の割合をwildtypeを基準に算出したところ、既存の蛍光性δC1bは10%なのに対し0.6nmリンカーを有する蛍光性δC1bは48%であることから、リンカー長を短くしたことでリガンド結合能を有するフォールディング状態の安定性が向上したと考えられる。蛍光性δC1bの構造安定性は評価系の再現性に大きく影響するため、これらの結果は蛍光性δC1bを用いる評価系を実用化するうえで重要な知見である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

海外渡航制度を利用して海外の研究室で研究活動を行っており、本来の研究計画とは異なる研究に従事しているため。

Strategy for Future Research Activity

蛍光を用いたPKCリガンドの2段階階評価系を構築するために、まずタンパク質側からのアプローチである蛍光性δClbドメインを用いる評価系の最適化を行う。最適条件を探索するための蛍光性δClbライブリーの作製において、Bode ligation法の利用を計画していたが、ペプチドのアミノ酸側鎖上でのligation反応が困難であることが考えられるため、これまでと同様に蛍光性Fmocアミノ酸を用いたペプチド固相合成法を用いることとする。その後、化合物ライブラリーに対して評価を行い、リガンド側からのアプローチである蛍光性DAG-lactoneをプローブとして用いる評価系との結果と比較し、2段階階評価系の実用化を目指す。バイオセンサーへの応用については研究計画の記載に従って行う予定である。

Report

(2 results)
  • 2011 Annual Research Report
  • 2010 Annual Research Report
  • Research Products

    (8 results)

All 2012 2011

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results) Presentation (4 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] Fluorescence-Quenching Screening of Protein Kinase C Ligands with an Environ mentally Sensitive Fluorophore2011

    • Author(s)
      Nomura, Wataru
    • Journal Title

      Bioconjugate Chem

      Volume: VOL.22 Issue: 5 Pages: 923-930

    • DOI

      10.1021/bc100567k

    • Related Report
      2011 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Synthetic Caged DAG-lactones for Photochemically-controlled Activation of Protein Kinase C2011

    • Author(s)
      Nomura, Wataru
    • Journal Title

      ChemBioChem

      Volume: VOL.12 Issue: 4 Pages: 535-539

    • DOI

      10.1002/cbic.201000670

    • Related Report
      2011 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Fluorescent-Responsive Synthetic C1b Domains of Protein Kinase Cδ as Reporters of Specific High-Affinity Ligand Binding2011

    • Author(s)
      Ohashi, Nami
    • Journal Title

      Bioconjugate Chemistry

      Volume: VOL.1 Pages: 82-87

    • Related Report
      2010 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] DAG lacton誘導体の合成とPKCリガンドの新規スクリーニング法の開発2012

    • Author(s)
      野村渉, 湊夏来, 大橋南美, 玉村啓和など
    • Organizer
      日本薬学会第132年会
    • Place of Presentation
      北海道大学札幌キャンパス(北海道)
    • Related Report
      2011 Annual Research Report
  • [Presentation] 環境応答性蛍光基を導入したprotein kinase Cδ C1bドメインによるリガンド結合活性評価2011

    • Author(s)
      大橋南美, 玉村啓和など
    • Organizer
      日本ケミカルバイオロジー学会第6回年会
    • Place of Presentation
      東京工業大学大岡山キャンパス(東京)
    • Related Report
      2011 Annual Research Report
  • [Presentation] 環境応答性蛍光基を活用したPKCリガンドのorthogonal screening methods2011

    • Author(s)
      大橋南美, 野村渉, 玉村啓和など
    • Organizer
      日本ケミカルバイオロジー学会第6回年会
    • Place of Presentation
      東京工業大学大岡山キャンパス(東京)
    • Related Report
      2011 Annual Research Report
  • [Presentation] Synthesis of C1b Domains of Protein Kinase C Having Solvatochromism and their Application to Bio-sensing2011

    • Author(s)
      Wataru, Nomura Nami Ohashi, Hirokazu Tamamura, et.al.
    • Organizer
      The 9th Australian Peptide Conference
    • Place of Presentation
      Hamilton Island (Queensland, Australia)
    • Related Report
      2011 Annual Research Report
  • [Book] Novel Tag-probe Pairs for Fluorescent Imaging of Proteins in Living Cells. Proceedings of the 5th International Peptide Symposium in conjunction with the 47th Japanese Peptide Symposium2011

    • Author(s)
      Wataru, Nomura Nami Ohashi Hirokazu Tamamura, et.al.
    • Total Pages
      1
    • Publisher
      Nobutaka Fujii and Yoshiaki Kiso (Eds.), The Japanese Peptide Society, Kyoto, Japan
    • Related Report
      2011 Annual Research Report

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Published: 2010-12-03   Modified: 2024-03-26  

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