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超好熱性DNAポリメラーゼによるde novo DNA合成の機構解明とその応用

Research Project

Project/Area Number 10J07957
Research Category

Grant-in-Aid for JSPS Fellows

Allocation TypeSingle-year Grants
Section国内
Research Field Chemistry related to living body
Research InstitutionNagoya University

Principal Investigator

加藤 智博  名古屋大学, 工学研究科, 特別研究員(DC1)

Project Period (FY) 2010 – 2012
Project Status Completed (Fiscal Year 2012)
Budget Amount *help
¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
Fiscal Year 2012: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Fiscal Year 2011: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Fiscal Year 2010: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
KeywordsDNA / FRET / 遺伝子検出 / 人工核酸 / 蛍光色素 / 配向依存性 / de novo DNA合成 / DNAポリメラーゼ / 非特異的増幅 / 電子移動 / 高輝度化 / 好熱性DNAポリメラーゼ / 遺伝子増幅 / PCR
Research Abstract

これまでの研究から、超好熱性DNAポリメラーゼによるde novo DNA合成の機構の解明に成功し、その抑制策を見出すことができた。しかしあくまで抑制にとどまり、遺伝子検出技術の感度低下を招く恐れが完全に排除できなかった。そこで、DNA増幅過程での不都合を検出過程での高感度化によりカバーするべく、蛍光色素を高輝度化させる新規人工分子インスレーター分子を開発し、蛍光色素導入人工核酸の高輝度化に成功した。さらに本年度は、励起光がバックグラウンドになるという問題を解決するため、FRETの利用を試みることにした。FRETを利用すれば、励起光と検出波長の差が大きくなり、バックグラウンドの問題を解決することができる。しかしこれを実現するためには、DNA二重鎖内における色素間の配向制御を明らかにし、配向の影響を考慮した検出用核酸プローブの設計を行う必要がある。そこで、DNA二重鎖内部に蛍光色素をインターカレートさせて厳密に固定し、距離および配向の制御を厳密に行うことのできるFRET実験系を新たに構築し、これまで非常に困難であった蛍光色素間のFRETの配向依存性を明確かつ詳細に調査することを目指した。その結果、蛍光色素間のFRET効率がDNAの構造由来の配向依存性によって大きく変化し、一定の周期間隔で変化することを見出した。得られた結果をもとに、DNAを剛直な円筒に見立てた簡便な理論モデルを考案し、FRET理論との比較を行った結果、DNA二重鎖内部におけるFRETの配向依存性を理論モデルによって精確に予測可能であることが分かった。この発見は物理化学的にも非常に興味深く、今後のFRETを利用したナノスケール分子のモニタリングツール開発等に大きく貢献できるものである。特に核酸プローブの設計に際しては、配向依存性をしっかりと考慮に入れて設計を行う必要があることも再確認できた。

Report

(3 results)
  • 2012 Annual Research Report
  • 2011 Annual Research Report
  • 2010 Annual Research Report
  • Research Products

    (15 results)

All 2013 2012 2011 2010 Other

All Journal Article (6 results) (of which Peer Reviewed: 6 results) Presentation (8 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Coherent Interactions of Dyes Assembled on DNA (Review)2012

    • Author(s)
      Asanuma, H.; Fujii, T.; Kato, T.; Kashida, H.
    • Journal Title

      J. Photochem. Photobiol. C

      Volume: 13 Issue: 2 Pages: 124-135

    • DOI

      10.1016/j.jphotochemrev.2012.04.002

    • Related Report
      2012 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Quencher-free linear probe with multiple fluorophores on acyclic scaffold2012

    • Author(s)
      Asanuma, H.; Akahane, M.; Kondo, N.; Osawa, T.; Kato, T.; Kashida, H.
    • Journal Title

      Chem. Sci.

      Volume: 3 Issue: 11 Pages: 3165-3169

    • DOI

      10.1039/c2sc20732j

    • Related Report
      2012 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A model of elongation of short DNA sequence by thermophilic DNA polymerase under isothermal conditions.2012

    • Author(s)
      Kato, T.; Liang, X.G.; Asanuma, H.
    • Journal Title

      Biochemistry

      Volume: 51 Issue: 40 Pages: 7846-7853

    • DOI

      10.1021/bi3010413

    • Related Report
      2012 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Development of a robust model system of FRET using base-surrogates tethering fluorophores for strict control of their position and orientation within DNA duplex.2012

    • Author(s)
      Kato, T.; Kashida, H.; Kishida, H.; Yada, H.; Okamoto, H.; Asanuma, H.;
    • Journal Title

      J. Am. Chem. Soc.

      Volume: 135 Issue: 2 Pages: 741-750

    • DOI

      10.1021/ja309279w

    • Related Report
      2012 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Photon-fueled DNA nanodevice carrying two different photoswitches2012

    • Author(s)
      Nishioka, H.; Liang, X.G.; Kato, T.; Asanuma, H.
    • Journal Title

      Angew.Chem.Int.Ed.

      Volume: 48 Issue: 5 Pages: 1760-1762

    • DOI

      10.1002/anie.201106093

    • Related Report
      2011 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Cyclohexyl "base pairs" stabilize duplexes and intensify pyrene fluorescence by shielding it from natural base pairs2011

    • Author(s)
      Kashida, H.; Sekiguchi, K.; Higashiyama, N.; Kato, T.; Asanuma, H.
    • Journal Title

      Ore.Biomol.Chem.

      Volume: 9 Pages: 8313-8320

    • Related Report
      2011 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] DNA二重鎖内部へ付加的に導入された色素間のFRETに関する研究(Oral)2013

    • Author(s)
      加藤智博・樫田啓・岸田英夫・矢田祐之・岡本博・浅沼浩之
    • Organizer
      日本化学会第93春季年会(2013)
    • Place of Presentation
      立命館大学
    • Year and Date
      2013-03-25
    • Related Report
      2012 Annual Research Report
  • [Presentation] Development of a robust FRET system within DNA duplex using base-surrogate tethering fluorophores(Poster)2012

    • Author(s)
      加藤智博・樫田啓・岸田英夫・矢田祐之・岡本博・浅沼浩之
    • Organizer
      The 39th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry (ISNAC2012)
    • Place of Presentation
      名古屋大学
    • Year and Date
      2012-11-15
    • Related Report
      2012 Annual Research Report
  • [Presentation] DNA二重鎖内部に固定化した蛍光色素間のエネルギー移動に関する研究(Oral)2012

    • Author(s)
      加藤智博・樫田啓・岸田英夫・矢田祐之・岡本博・浅沼浩之
    • Organizer
      光化学討論会2012
    • Place of Presentation
      東京工業大学
    • Year and Date
      2012-09-13
    • Related Report
      2012 Annual Research Report
  • [Presentation] DNA二重鎖内部に導入した蛍光色素間のFRET効率に関する研究(Poster)2012

    • Author(s)
      加藤智博・樫田啓・岸田英夫・矢田祐之・岡本博・浅沼浩之
    • Organizer
      第6回バイオ関連化学シンポジウム-第27回生体機能関連化学シンポジウム、第15回バイオテクノロジー部会シンポジウム、第15回生命化学研究会シンポジウム-
    • Place of Presentation
      北海道大学
    • Year and Date
      2012-09-07
    • Related Report
      2012 Annual Research Report
  • [Presentation] 蛍光色素の高輝度化を目指した新規人工塩基対の開発2011

    • Author(s)
      加藤智博・樫田啓・浅沼浩之
    • Organizer
      第5回バイオ関連化学シンポジウム
    • Place of Presentation
      エポカルつくば(茨城県)
    • Year and Date
      2011-09-12
    • Related Report
      2011 Annual Research Report
  • [Presentation] 人工塩基対導入による蛍光色素の高輝度化2011

    • Author(s)
      加藤智博・樫田啓・浅沼浩之
    • Organizer
      生体機能関連化学部会第26回若手フォーラム
    • Place of Presentation
      筑波大学(茨城県)
    • Year and Date
      2011-09-11
    • Related Report
      2011 Annual Research Report
  • [Presentation] Unexpected non-specific DNA synthesis by thermophilic DNA polymerase2010

    • Author(s)
      加藤智博
    • Organizer
      PACIFICHEM 2010
    • Place of Presentation
      ホノルルコンベンションセンター(ハワイ)
    • Year and Date
      2010-12-17
    • Related Report
      2010 Annual Research Report
  • [Presentation] 超好熱性DNAポリメラーゼによるde novo DNA合成の機構解明2010

    • Author(s)
      加藤智博
    • Organizer
      第4回バイオ関連化学シンポジウム2010
    • Place of Presentation
      大阪大学 豊中キャンパス(大阪府)
    • Year and Date
      2010-09-25
    • Related Report
      2010 Annual Research Report
  • [Remarks]

    • URL

      http://www.nubio.nagoya-u.ac.jp/seigyol/member_kato.html

    • Related Report
      2012 Annual Research Report

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Published: 2010-12-03   Modified: 2024-03-26  

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