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ボツリヌス毒素複合体構成成分の無毒タンパク質を用いた経口的薬物送達システムの開発

Research Project

Project/Area Number 10J08286
Research Category

Grant-in-Aid for JSPS Fellows

Allocation TypeSingle-year Grants
Section国内
Research Field Drug development chemistry
Research InstitutionTokyo University of Agriculture

Principal Investigator

宮田 恵多  東京農業大学, 生物産業学部, 特別研究員(PD)

Project Period (FY) 2010 – 2011
Project Status Completed (Fiscal Year 2011)
Budget Amount *help
¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
Fiscal Year 2011: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Fiscal Year 2010: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Keywordsボツリヌス毒素 / 無毒タンパク質 / タンパク質間相互作用 / 細胞毒性 / タンパク質結晶化 / 薬物送達システム / 複合体タンパク質 / 分子間相互作用
Research Abstract

ボツリヌス菌の産生する神経毒素は、A~Gの7種の血清型に分類され、種々の無毒タンパク質成分(NTNHA、HAs)と会合した毒素複合体(TC)として存在している。NTNHAは、神経毒素をプロテアーゼの分解から保護する。このNTNHAを経口的に摂取が困難なペプチド・タンパク質製剤を体内へ経口的に送達させる輸送容器として応用可能ではないかと考えられる。本研究では、D型NTNHAを新規ペプチド・タンパク質製剤輸送容器として応用するために、NTNHAのX線結晶構造解析、NTNHA-神経毒素間相互作用領域解析ならびに細胞毒性試験を行った。NTNHAの結晶化をハンギングドロップ蒸気拡散法で行った結果、0.2×0.1×0.1cmの結晶が析出した。さらに回折実験を行い、最高分解能3.9Å、P321あるいはP3121/P3221に属し、格子定数はa=b=147.85Å、c=229.74Åと測定された。神経毒素とNTNHAの相互作用領域を解析するためにC型、他のD型菌株の産生する神経毒素とNTNHAの再構成試験を行った。全ての神経毒素はD型NTNHAと複合体を形成した。それぞれの解離定数を求めた結果、C型神経毒素が最も強い値を示した。神経毒素のアミノ酸配列を比較したところC型神経毒素のC末端側配列の相同性が高い神経毒素が強い相互作用を示したことから神経毒素とNTNHAの結合は神経毒素のC末端側の関与が考えられた。NTNHAの小腸上皮細胞に対する細胞毒性を培養液中のラクテイトデヒドロゲナーゼ(LDH)の量を測定した。その結果、NTNHAを添加した細胞の培養液中のLDH量は何も添加していない細胞培養液のLDH量と同等の値を示した。このことから、NTNHAは細胞毒性を示さないことが明らかとなった。これらの結果は、新規薬物送達システムを確立する上で重要な知見であると考えられる。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、研究対象としているボツリヌス毒素複合体構成成分のNTNHAの結晶化に成功し、その構造解析に取り組むことができた。また、NTNHAに他の血清型の神経毒素が結合するとが明らかとなり、さらに神経毒素-NTNHA間の相互作用には神経毒素のC末端側が関与していることが考えられた。しかしながら、NTNHAにシクロデキストリン等の包接化合物を結合させた複合体等の作製にはいたっておらず、このような複合体の作製が、今後の課題である。

Strategy for Future Research Activity

今後、NTNHAの構造解析、ならびに神経毒素-NTNHA間相互作用領域を明らかにする。NTNHAの構造、神経毒素-NTNHA間相互作用領域が明らかとなれば、神経毒素とNTNHAの結合に関与する配列が明らかとなる。その配列をペプチド合成しNTNHAと相互作用するかを調べ、相互作用したペプチド配列をタグとして応用し、有用なペプチド・タンパク質製剤に融合あるいは化学結合させ、NTNHA/ペプチド・タンパク質製剤複合体の作製を目指す。作製した新規複合体タンパク質製剤のマウス経口投与試験等を行い、その有用性を試験することで、将来、ボツリヌス無毒タンパク質成分を応用した新しいタンパク質薬物送達システムを確立することが出来ると考えられる。

Report

(2 results)
  • 2011 Annual Research Report
  • 2010 Annual Research Report
  • Research Products

    (26 results)

All 2012 2011 2010 Other

All Journal Article (5 results) (of which Peer Reviewed: 5 results) Presentation (19 results) Remarks (2 results)

  • [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray analysis of the Clostridium botulinum type D nontoxic nonhaemagglutinin2012

    • Author(s)
      Miyata, K., Inui, K., Miyashita, S., Sagane, Y., Hasegawa, K., Matsumoto, T., Yamano, A., Niwa, K., Watanabe, T., Ohyama, T.
    • Journal Title

      Acta Crystallographica Section F

      Volume: 68 Issue: 2 Pages: 227-230

    • DOI

      10.1107/s174430911105603x

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    • Author(s)
      Inui, K., Sagane, Y., Miyata, K., Miyashita, S., Suzuki, T., Sikamori, Y., Ohyama, T., Niwa, K., Watanabe, T.
    • Journal Title

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      Volume: 419 Issue: 3 Pages: 500-504

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2012.02.045

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  • [Journal Article] HA-33 facilitates transport of the serotype D botulinum toxin across a rat intestinal epithelial cell monolayer2011

    • Author(s)
      Ito, H., Sagane, Y., Miyata, K., Inui, K., Matsuo, T., Horiuchi, R., Ikeda, T., Suzuki, T., Hasegawa, K., Kouguchi, K., Oguma, K., Niwa, K., Ohyama, T., Watanabe T.
    • Journal Title

      FEMS Immunology Medicul Microbiology

      Volume: 61 Issue: 3 Pages: 323-331

    • DOI

      10.1111/j.1574-695x.2011.00779.x

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    • Author(s)
      Matsuo, T., Miyata, K., Inui, K., Ito, H., Horiuchi, R., Suzuki, T., Yoneyama, T., Oguma, K., Niwa, K., Watanabe, T., Ohyama, T.
    • Journal Title

      FEMS Immunology Medicul Microbiology

      Volume: 63 Issue: 1 Pages: 35-43

    • DOI

      10.1111/j.1574-695x.2011.00825.x

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      Ken Inui
    • Journal Title

      Journal of Veterinary Medical Science

      Volume: 72 Pages: 1251-1255

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      犬井健、相根義昌、宮田恵多、宮下慎一郎、鈴木智典、丹羽光一、大山徹、渡部俊弘
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      第85回日本細菌学会
    • Place of Presentation
      長崎新聞文化ホール
    • Year and Date
      2012-03-29
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      相根義昌、林慎太郎、宮田恵多、犬井健、宮下慎一郎、鈴木智典、丹羽光一、大山徹、渡部俊弘
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      第85回日本細菌学会
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      長崎新聞文化ホール
    • Year and Date
      2012-03-29
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      宮下慎一郎、吉田悠真、狩野聡史、宮田恵多、犬井健、村松将司、川根武紘、栗原小百合、林慎太郎、渡部俊弘、大山徹、丹羽光一
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      第84回日本生化学会大会
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      京都国際会館
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      2011-09-24
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      犬井健、宮田恵多、宮下慎一郎、長谷川仁子、松本崇、山野昭人、林慎太郎、丹羽光一、渡部俊弘、大山徹
    • Organizer
      第84回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      京都国際会館
    • Year and Date
      2011-09-24
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  • [Presentation] D型ボツリヌス毒素複合体の小腸上皮細胞層透過経路に関する研究2011

    • Author(s)
      吉田悠真、宮下慎一郎、狩野聡史、宮田恵多、犬井健、村松将司、川根武紘、栗原小百合、林慎太郎、渡部俊弘、大山徹、丹羽光一
    • Organizer
      第84回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      京都国際会館
    • Year and Date
      2011-09-24
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  • [Presentation] ボツリヌスD型菌1873株の産生する毒素複合体構成成分HA-33の変異による毒素複合体の糖認識の改変2011

    • Author(s)
      宮田恵多、犬井健、宮下慎一郎、村松将司、吉田悠真、狩野聡史、川根武紘、栗原小百合、林慎太郎、渡部俊弘、大山徹、丹羽光一
    • Organizer
      第84回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      京都国際会館
    • Year and Date
      2011-09-22
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  • [Presentation] ボツリヌスC型菌変異株C-Yoichiの産生する毒素複合体の糖認識特性2011

    • Author(s)
      松尾智仁、林慎太郎、宮田恵多、犬井健、伊藤博章、堀内亮太、鈴木智典、米山徹、小熊恵二、丹羽光一、渡部俊弘、大山徹
    • Organizer
      第84回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      京都国際会館
    • Year and Date
      2011-09-22
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  • [Presentation] ボツリヌス毒素複合体形成におけるボツリヌス神経毒素および非毒非血球凝集素間の相互作用の解析2011

    • Author(s)
      村松将司、宮田恵多、犬井健、宮下慎一郎、吉田悠真、狩野聡史、川根武紘、栗原小百合、林慎太郎、丹羽光一、渡部俊弘、大山徹
    • Organizer
      第84回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      京都国際会館
    • Year and Date
      2011-09-22
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  • [Presentation] The role of nontoxic-nonhemaggulutinin component of toxin coplex produced by Clostridium botulinum2011

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      Keita Miyata, Ken Inui, Masashi Muramatsu, Shin-Ichiro Miyashita, Yuhma Yoshida, Tomonori Suzuki, Keiji Oguma, Koichi Niwa, Tbshihiro Watanabe, Tohru Ohyama
    • Organizer
      International Union of Microbiological Societies 2011
    • Place of Presentation
      札幌コンベンションセンター
    • Year and Date
      2011-09-07
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  • [Presentation] Structure determination of toxin complex from Clostridium botulinum serotype D2011

    • Author(s)
      Kimiko Hasegawa, Takashi Matsumoto, Akihito Yamano, Keita Miyata, Ken Inui, Koichi Niwa, Toshihiro Watanabe, Tohru Ohyama
    • Organizer
      XXII Congress and General Assembly of the International Union of Crystallography
    • Place of Presentation
      マドリッド(スペイン)
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  • [Presentation] ボツリヌス毒素複合体の無毒成分を用いたタンパク質・ペプチド製剤送達システムの基礎的検討2010

    • Author(s)
      宮田恵多
    • Organizer
      第33回日本分子生物学会年会、第83回日本生化学会大会 合同大会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド(神戸市)
    • Year and Date
      2010-12-10
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  • [Presentation] C型ボツリヌス毒素の小腸上皮細胞からの侵入機構の解析2010

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      犬井健
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      第33回日本分子生物学会年会、第83回日本生化学会大会 合同大会
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      神戸ポートアイランド(神戸市)
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      2010-12-10
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  • [Presentation] D型ボツリヌス毒素複合体の小腸上皮細胞の透過におけるMAPキナーゼの役割2010

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      宮下慎一郎
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      神戸ポートアイランド(神戸市)
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      2010-12-10
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    • Author(s)
      堀内亮太
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      第33回日本分子生物学会年会、第83回日本生化学会大会 合同大会
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      神戸ポートアイランド(神戸市)
    • Year and Date
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      2010-09-17
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      宮田恵多
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      酪農学園大学(江別市)
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      2010-09-04
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    • Author(s)
      犬井健
    • Organizer
      第78回日本細菌学会北海道支部総会・第28回日本クラミジア研究会合同学術集会
    • Place of Presentation
      酪農学園大学(江別市)
    • Year and Date
      2010-09-04
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  • [Presentation] ボツリヌス毒素複合体構成成分の 130kDa 非毒非血球凝集素の結晶化およびX線回折強度測定2010

    • Author(s)
      堀内亮太
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      第78回日本細菌学会北海道支部総会・第28回日本クラミジア研究会合同学術集会
    • Place of Presentation
      酪農学園大学(江別市)
    • Year and Date
      2010-09-04
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  • [Presentation] D型ボツリヌス毒素複合体による小腸上皮細胞のMAPキナーゼ活性化2010

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      宮下慎一郎
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      第78回日本細菌学会北海道支部総会・第28回日本クラミジア研究会合同学術集会
    • Place of Presentation
      酪農学園大学(江別市)
    • Year and Date
      2010-09-04
    • Related Report
      2010 Annual Research Report
  • [Remarks]

    • URL

      http://www.bioindustry.nodai.ac.jp/~seika/

    • Related Report
      2011 Annual Research Report
  • [Remarks]

    • URL

      http://www.bioindustry.nodai.ac.jp/~seika/

    • Related Report
      2010 Annual Research Report

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Published: 2010-12-03   Modified: 2024-03-26  

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