極限微生物に由来する多糖分解酵素の構造―活性相関と糖鎖認識機構

• Project/Area Number: 11121211
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 中村 聡 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (50227899)
• Project Period (FY): 1999
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1999)
• Budget Amount: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000); Fiscal Year 1999: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
• Keywords: キシラナーゼ / タンパク質工学 / 進化分子工学 / 触媒ドメイン / 反応至適pH / キシラン結合ドメイン / ファージディスプレイ / 糖鎖認識

Research Abstract

好アルカリ性バシラス属細菌41M-1株キシラナーゼは触媒ドメインとキシラン結合ドメイン(XBD)から構成される.41M-1株キシラナーゼの触媒ドメインについて,タンパク質工学的検討を行った.Asn44を酸性アミノ酸Aspに置換したところ,反応の至適がアルカリ性(pH9.0)からが中性(pH6.0)へとシフトすることがわかった.
次に,進化分子工学によるXBDの機能変換を試みた.ファージベクターfNE2を用い,繊維状ファージの外殻タンパク質gIIIpのアミノ末端に相当する位置に41M-1株キシラナーゼ遺伝子XBD領域を連結した.この組換えファージDNAを導入した大腸菌より調製した組換えファージは不溶性キシランヘの高い結合能を有しており,XBDがファージ表面に正しくディスプレイされていることが示された.Error-prone PCRによりXBD遺伝子にランダム変異導入を行った.変異導入後のXBD遺伝子をfNE2に挿入した後,大腸菌に導入し,約20,000株の変異体を含むファージライブラリーを作製した.ファージライブラリー溶液を不溶性キシラン充てんカラムに通し,流出した画分を回収して大腸菌に再感染させた.感染後の大腸菌からファージ粒子を調製し,上の操作を繰り返すことにより,不溶性キシラン結合能が野生型XBDの1/1,000以下に低下した変異体10株を選抜した.得られた変異型XBD遺伝子の塩基配列解析により,XBD中のW317およびF284が不溶性キシランヘの結合に重要な役割を果たしていることが明らかとなった.

Research Products

• [Publications] S. Nakamura et al.: "Secretionl Expression of Bacillus subtilis Xylanase Gene in the Basidiomycete Coprinus cinereus"FEMS Microbiol. Lett.. 178. 277-282 (1999)
• [Publications] S. Nakamura et al.: "Transcriptional Regulation of Cruxrhodopsin Gene from Extremely Halophilic Archaeon Haloarcula japonica Strain TR-1"Necleic Acids Symp. Ser.. 42. 73-74 (1999)
• [Publications] S. Nakamura et al.: "Molecular Cloning of A1-ATPase Gene from Extremely Halophilic Archaeon Haloarcula japonica Strain TR-1"Necleic Acids Symp. Ser.. 42. 75-76 (1999)
• [Publications] S. Nakamura et al.: "A Novel Bacteriorhodopsin-like Protein from Haloarcula japonica Strain Tr-1 : Gene Cloning, Sequencing and Transcription Analysis"Extremophiles. (印刷中). (2000)
• [Publications] S. Nakamura et al.: "Purification and Characterization of a Ferredoxin from Haloarcula japonica Strain TR-1"BioMetals. (印刷中). (2000)
• [Publications] S. Nakamura et al.: "Purification and Some Properties of Basic Xylanase Produced by Thermoalkaliphilic Bacillus sp. Strain TAR-1"Biosci. Biotechnol. Biochem.. (印刷中). (2000)
• [Publications] 中村聡ほか(共著): "タンパク質-科学と工学"講談社サイエンティフィク. 210 (1999)
• [Publications] S. Nakamura et al.: "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation"Uni Publishers Co., Ltd.. 650 (1999)