抗原のB細胞認識に基づく効率的新規モノクローナル抗体作製法の開発

Research Project

Project/Area Number	11132231
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Mie University
Principal Investigator	冨田昌弘三重大学, 工学部, 助教授 (20183494)
Project Period (FY)	1999
Project Status	Completed (Fiscal Year 1999)
Budget Amount *help	¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000) Fiscal Year 1999: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Keywords	B細胞認識 / 電気パルス融合法 / ミエローマ細胞 / アビジン / ビオチン / モノクローナル抗体 / 可視化解析 / ペプチド
Research Abstract	抗原のB細胞認識に基づて効率的モノクロナール抗体作製法の基本原理は、1)抗原によるB細胞認識を利用した目的の抗体産生B細胞の選択、2)ビオチン-アビジン間の特異的親和力に基づく、ミエローマ細胞と抗原選択されたB細胞との架橋形成、3)電気パルスを利用した目的のB細胞-ミエローマ細胞複合体の選択的融合である。本研究では蛍光標識を利用した可視化解析法を用いることにより各ステップの実証明を行った。まず、ペプチド抗原によるB細胞認識の解析には、抗原選択されたB細胞-抗原-アビジン複合体を特異的蛍光標識物質ビオチン-フィコエリスリン(PE)を利用して検出した。また、ビオチン化ミエローマ細胞は、ストレプトアビジン-ローダミン(Rh)によって蛍光標識を行い検証した。一方、抗原選択されたB細胞-ミエローマ細胞複合体の場合は、B細胞に対しては抗原-フルオレッセインイソチオシアネート(FITC)、また、ミエローマ細胞に対してはストレプトアビジン-Rhによって蛍光標識を行い解析した。この方法は、蛍光波長の異なる2種の蛍光物質で各々の細胞を標識することによって、B細胞は緑色に、また、ミエローマ細胞は赤色にラベルされ、目的のB細胞-ミエローマ細胞複合体を可視的に検出できる特徴を持つ。また、さらに、2重蛍光標識された両細胞に対して矩形波の電気パルスを負荷して融合させたところ、FITCの緑色とRhの赤色の混合色である黄色を呈するハイブリドーマを確認することができた。以上の解析結果より、この方法の各ステップが予測に基づき推移していることを初めて明らかにすることに成功した。今後、新規法のさらなる進展を目指し、通常1ヵ月程の免疫期間を要する生体内免疫法の代わりに、3〜5日間で免疫化が完了する生体外免疫法を利用し、短期間でしかも効率的に目的のモノクローナル抗体を作製できる汎用法へと発展させたいと考えている。