ファージディスプレーを用いた進化分子工学による酵素機能の改変

• Project/Area Number: 11132236
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 江崎 信芳 京都大学, 化学研究所, 教授 (50135597)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 栗原 達夫 京都大学, 化学研究所, 助手 (70243087) ; 吉村 徹 京都大学, 化学研究所, 助教授 (70182821)
• Project Period (FY): 1999
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1999)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 1999: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: ファージディスプレー / 進化分子工学 / DnaK / グルタミン酸ラセマーゼ

Research Abstract

本研究では、ファージディスプレー法の生物工学研究への応用として、E.coliの機能未知のHsp70ホモログの解析や酵素の高機能化に関する研究を行った。まず我々がE.coliに見い出した新しいHsp70ホモログ、Hsc62の基質選択性について考察するため、ランダムな8残基のペプチドを呈示したファージライブラリーを用いて、DnaKとHsc62に結合するペプチドの相違を検討した。この結果、Hsc62とDnaKはともに疎水的アミノ酸を多く含むペプチドを呈示したファージと結合したが、Hsc62の場合には、DnaKに比べて酸性アミノ酸含量の多いペプチドを好む傾向が得られた。これはHsc62のペプチド結合部位に、DnaKではMetとなっているHis残基が存在するというホモロジーモデリングの結果を反映していた。本研究ではまた、ファージディスプレーを用いた進化分子工学の手法の効率化を目指した。進化分子工学の手法により、ある酵素の基質特異性を転換する場合は、遺伝子にランダム変異を加え、酵素がその基質と反応するようになった場合にのみ、宿主の生育が可能となるような系を構築する。しかし宿主細胞への基質の取り込み能が低い場合には、酵素を菌体外へ分泌させるなどの必要がある。この問題を解決する方法として、ファージコート上に標的酵素を発現させることを考え、モデルとして、グルタミン酸に特異性が高いPedlococcus pentosaceusのグルタミン酸ラセマーゼのアスパラギン酸ラセマーゼへの変換を検討した。この結果、M13ファージコート上へのGluR融合タンパク質の発現に成功したが、酵素活性は検出されなかった。これは融合タンパク質蛋白質の発現量が少ないか、当初モノマーと考えられていたGRがダイマーであったためと考えられた。