| Project/Area Number |
11132238
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
山本 憲二 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (70109049)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
玉置 尚徳 京都大学, 生命科学研究科, 助手 (20212045)
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| Project Period (FY) |
1999
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1999)
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| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 1999: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
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| Keywords | 乳酸菌 / 細胞接着 / 糖鎖 / 表層タンパク質 / セルフクローニング / Lactobacillus属 |
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| Research Abstract |
本研究では、"乳酸菌の細胞接着に関わる表層タンパク質"について、大腸菌における発現を試み、得られた本タンパク質を解析するとともにその遺伝子を乳酸菌へセルフクローニングして、菌体表層に本タンパク質を発現するようにデザインした組換え乳酸菌を取得することを目的とした。
1)Lactobacillus caseiの糖鎖受容体タンパク質の遺伝子を含む組換えプラスミドpR3Eを導入した大腸菌DH5 αの無細胞抽出液について、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、L.caseiの糖鎖受容体タンパク質とほぼ同じ分子サイズの位置にタンパク質が強く発現していた。
2)組換え大腸菌の無細胞抽出液を菌体表層画分と細胞質画分に分けてポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、両画分に糖鎖受容体タンパク質が発現していることを確認した。
3)糖鎖受容体タンパク質が他のLactobacillus属乳酸菌にも存在するかを調べるために、本遺伝子を含むDNA断片をプローブとして、種々のLactobacillus属乳酸菌のゲノムDNAをサザンブロッティング解析した結果、調べた全てのLactobacillus属乳酸菌のゲノムDNA上に本タンパク質の遺伝子が存在していることが示された。
4)組換え大腸菌で発現した糖鎖受容体タンパク質をウサギに免疫して得られた抗体を用いて、本タンパク質の遺伝子を持つLactobacillus属乳酸菌の無細胞抽出液についてウエスタンブロッティング解析を行った結果、L.paracaseiなどには本タンパク質が存在することが示されたが、その他のLactobacillus属乳酸菌は本タンパク質を発現していないことがわかった。即ち、本遺伝子を持つLactobacillus属乳酸菌の全てが本タンパク質を発現している訳ではないことが示唆された。
5)糖鎖受容体タンパク質の遺伝子をシャトルベクターpBE32に組み込み、得られたプラスミドpNK5をエレクトロポレーション法によって、本タンパク質を発現していない乳酸菌L.rhamnosus JCM2771に導入した。その結果、得られたL.rhamnosus pNK5/2771は本タンパク質を発現していることをウエスタンブロッテイング解析によって確認した。
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