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¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000)
Fiscal Year 1999: ¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000)
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| Research Abstract |
1.最小プロモーターを用いたCO2応答性転写調節領域の同定
クラミドモナス炭酸脱水酵素遺伝子CAH1上流域に予測された転写調節領域をβ2-チューブリンの最小プロモーターに連結して転写調節領域を更に短い領域に限定することができた。高CO2条件で転写抑制を担う領域(S-region)は,-351から-294の58塩基であり,低CO2で転写を活性化する領域(E-region)は,-293から-231の63塩基であった。この部分についてリンカースキャニング法により,転写調節シス配列を推定した。 高CO2で培養した細胞と低CO2条件に移して2時間処理した細胞から単離した核抽出液を用いて,E-regionとS-regionについてゲルシフトアッセイを行った。E-regionでは,低CO2の核抽出液で1本、高CO2の核抽出液では3本の移動度の異なるバンドを検出した。S-regionでは,低CO2の核抽出液で1本、高CO2の核抽出液では2本の移動度の異なるバンドを検出した。どちらの領域にも,低CO2、高CO2条件で、異なる複数種のタンパク質がDNAに特異的に結合し,転写活性を制御していると考えられた。
2.遺伝子タギング法によって得た高CO2要求性変異株C16
低CO2条件に順化できない変異株C16の変異原因遺伝子CCM1をタギングによって単離した。細胞内での発現量は,非常に低かったことから,RT-PCRをおこない,全長cDNAを得た。cDNAのタンパク質コード領域を大腸菌発現ベクターに導入し,ヒスチジンタグを付けて大腸菌からタンパク質を回収し,抗体の作製を行った。また,遺伝子産物の細胞内局在を明らかにするために,推定タンパク質のC-末端にHAタグを付けたプラスミドを作製し,変異株C16に形質転換して変異が相補した株を単離した。HA抗体を用いて,変異相補株におけるCCM1タンパク質の細胞内局在を調べている。このタンパク質遺伝子は、CO2濃度を検知・制御するシグナル伝達系に関わる遺伝子である可能性が高い。
3.CO2濃度変化に応答できない変異株の単離
高CO2条件でもCAH1遺伝子が恒常的に発現してしまう株をNIT1遺伝子の挿入変異によって新しく2株得た。また、同じ変異株ライブラリーから低CO2条件でレポーター遺伝子が発現しなくなる株を4株得た。変異株の中には,CAH1遺伝子の転写調節に直接関わる因子が変異していると考えられる株が含まれていた。
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